一种胞嘧啶核苷生产菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种胞嘧啶核苷生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术在E.coliUR12基因组上构建获得,敲除cdd基因、cmk基因；弱化核苷三磷酸还原酶基因nrdD；过表达核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG、核苷二磷酸激酶基因ndk和携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH<subgt;(D93A)</subgt;，异源引入且多拷贝谷氨酸棒状杆菌携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG<subgt;(D160E、E162A、E168K，cgl)</subgt;和酿酒酵母的双功能核苷酸酶基因PHM8<subgt;(sce)</subgt;，所获得的菌株遗传稳定性好、发酵产率高，可稳定生产胞嘧啶核苷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及代谢工程及基因工程，尤其是一种胞嘧啶核苷生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

1、胞嘧啶核苷，又称胞嘧啶核糖核苷，简称胞苷，是构成核酸的嘧啶核苷之一，参与生物体内各种生理生化过程，在生物体中起到重要的代谢、遗传等调控作用。此外，胞苷也是重要的医药合成中间体，因其干扰核糖核酸合成的性质，常被用作合成阿糖胞苷、阿扎胞苷、扎西他滨等抗肿瘤和抗病毒药物的原料和中间体。现如今，关于胞苷的应用研究开发仍在进行，亟待寻求一种更高效的合成方法。

2、胞嘧啶核苷的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法。传统的胞苷生产工艺多依赖化学合成，但该方法存在诸多问题，包括反应条件苛刻、环境污染严重以及生产成本较高。为了克服这些问题，近年来，微生物发酵法逐渐成为胞苷制备的研究热点。微生物发酵法通过代谢工程改造微生物，可以实现胞苷的高效生物合成。这种方法利用葡萄糖为原料，通过发酵工艺生产胞苷，具有绿色环保、成本低廉和生产条件温和等优点。近年来，合成生物学技术的发展进一步提升了发酵法的效率，使其成为工业生产的主流选择。因此，构建一株遗传背景清晰、稳定性好、产量本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株E.coliUR12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在E.coliUR12基因组上敲除cdd基因、cmk基因，弱化核苷三磷酸还原酶基因nrdD，过表达核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG、核苷二磷酸激酶基因ndk和携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrH(D93A)，异源引入表达谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrG(D160E、E162A、E168K，cgl)和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288c的双...

【技术特征摘要】

1.一种胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株e.coliur12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在e.coliur12基因组上敲除cdd基因、cmk基因，弱化核苷三磷酸还原酶基因nrdd，过表达核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudg、核苷二磷酸激酶基因ndk和携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrh(d93a)，异源引入表达谷氨酸棒状杆菌corynebacterium glutamicum atcc 13032的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrg(d160e、e162a、e168k，cgl)和酿酒酵母saccharomyces cerevisiae s288c的双功能核苷酸酶基因phm8(sce)；其中，核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudg、携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrh(d93a)和携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrg(d160e、e162a、e168k，cgl)是通过人工操纵子pyrg(d160e、e162a、e168k，cgl)-pyrh（d93a)-ndk来进行同步多拷贝的。

2.根据权利要求1所述的胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：所述人工操纵子pyrg(d160e、e162a、e168k，cgl)-pyrh（d93a)-ndk的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示。

3.根据权利要求1所述的胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：所述基因组上敲除cdd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；cmk基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：用人工启动子pbba_j23114替换核苷三磷酸还原酶基因nrdd的天然启动子，所述核苷三磷酸还原酶基因nrdd的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示，所述人工启动子pbba_j23114的核苷酸序列如序列表seq idno.4所示，所述核苷三磷酸还原酶基因nrdd的天然启动子核苷酸序列如序列表seq idno.5所示。

5.根据权利要求1所述的胞嘧啶核苷生产菌株，其特征在于：在fhia、yjiv、yeel三个位点上依次整合核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudg，并用人工启动子trc调控；所述人工启动子trc的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示，核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudg核苷酸序列如序列表seq id...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，赵润泽，李长庚，范文静，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：