【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质组学方法，具体涉及一种同时检测蛋白质磷酸化和s-亚硝基化的方法。
技术介绍
1、翻译后修饰（ptms）是蛋白质功能和活性的动态调节器。在已知的400多种翻译后修饰（ptms）中，可逆磷酸化因在真核生物信号转导、蛋白互作、酶活性调节及亚细胞定位中发挥核心作用，成为研究最为深入的ptm类型。与此同时，蛋白质 s-亚硝基化（一种通过氧化还原反应将一氧化氮（no）分子连接到蛋白质的半胱氨酸残基上的修饰方式）也因其类似于磷酸化的调控功能而备受关注。最近的研究揭示了s-亚硝基化广泛参与植物生长发育调控及逆境胁迫应答的分子机制。
2、蛋白质通常会在多个位点发生不同类型的修饰，不同的翻译后修饰（ptms）之间的相互作用为蛋白质组增添了额外的调控层次，也使其变得更加复杂。越来越多的研究表明，磷酸化和s-亚硝基化之间存在复杂的串扰。例如，在拟南芥中，水杨酸结合蛋白sabp3的磷酸化需要先进行s-亚硝基化，而在bik1蛋白中，磷酸化则发生在s-亚硝基化之前，共同调控免疫信号。这...
【技术保护点】
1.一种同时检测蛋白质磷酸化和S-亚硝基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述磷酸亲和标签为碘乙酰胺基-LC-膦酸，其结构为：。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）蛋白质标记前用碘乙酰胺封闭游离硫醇，再用抗坏血酸钠还原S-亚硝基化修饰，标记后蛋白质酶解前还包括对二硫键的还原处理和烷基化处理，所用试剂包括三(2-羧乙基)膦/2-氯乙酰胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：蛋白质标记前用碘乙酰胺封闭游离硫醇，接着通过沉淀蛋白去除杂质，再用...
【技术特征摘要】
1.一种同时检测蛋白质磷酸化和s-亚硝基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述磷酸亲和标签为碘乙酰胺基-lc-膦酸，其结构为：。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）蛋白质标记前用碘乙酰胺封闭游离硫醇，再用抗坏血酸钠还原s-亚硝基化修饰，标记后蛋白质酶解前还包括对二硫键的还原处理和烷基化处理，所用试剂包括三(2-羧乙基)膦/2-氯乙酰胺。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：蛋白质标记前用碘乙酰胺封闭游离硫醇，接着通过沉淀蛋白去除杂质，再用抗坏血酸钠还原s-亚硝基化修饰，并用6c-cyspat实现标记，随后用丙酮沉淀蛋白以去除多余的6c-cyspat试剂；复溶蛋白后用三(2-羧乙基)膦/2-氯乙酰胺还原并封闭二硫键，最后蛋白质被胰蛋白酶酶解成肽段，得到磷酸化肽、pat标记肽和未修饰肽的混合物；磷酸化肽和pat标记肽通过金属氧化物/固定化金属离子亲和层析技术同时富集；富集的肽段通过液相色谱-串联质谱进行分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，蛋白质标记前用碘乙酰胺封闭游离硫醇，接着通过沉淀蛋白去除杂质，具体步骤如下：蛋白重悬于hens缓冲液中，加入碘乙酰胺至终浓度 100 mm，随后在 37°c 下振荡孵育 1 小时，将混合物涡旋，加入丙酮沉淀蛋白，或使用酚抽提蛋白后加入甲醇沉淀蛋白，离心后，蛋白质沉淀洗涤并在空气中干燥。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用抗坏血酸钠还原s-亚硝基化修饰，并用6c-cyspat标记，用丙酮沉淀去除多余的6c-cyspat试剂，具体步骤如下：将蛋白质沉淀重悬于含有抗坏血酸钠和6c-cyspat的hens缓冲液中，37°c下轻轻滚动孵育1小时，然后进行快速蛋白质沉淀，离心后，蛋白质沉淀用含10 mm nacl的80vol%丙酮洗涤两次，并在空气中干燥5分钟得到s-亚硝基化修饰被pat-switch的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，快速进行蛋白质沉淀的方法如下：将37°c下轻轻滚动孵育1小时的混合液与1/10体积的1m nacl混匀，并在室温下用5倍体积丙酮共孵育30分钟。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用tcep/caa还原并封闭二硫键，最后蛋白质被胰蛋白酶酶解成肽段，得到磷酸化肽、pat标记肽和未修饰...
【专利技术属性】
技术研发人员：张文洋，晏石娟，王炎姣，李文燕，黄文洁，叶明洋，谭国督，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。