【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析检测，是一种基于高效液相色谱-二极管阵列检测器(high performance liquid chromatography-diode array detection，hplc-dad)定量检测gdp-l-岩藻糖的方法。
技术介绍
1、gdp-l-岩藻糖是糖基化修饰的关键底物，广泛应用于医药、食品、保健品等领域，具有巨大的市场开发潜力。由于gdp-l-岩藻糖在相关生物反应以及人类治疗相关疾病中发挥着重要作用且造价昂贵，所以其纯度提高和定量分析对药物开发至关重要。目前其检测方法多依赖薄层色谱法、气相色谱法、普通液相色谱法和液相色谱-质谱分析法。gdp-l-岩藻糖的极性非常大，不易挥发，用气相色谱检测前处理需要衍生化，操作繁琐。薄层色谱法是正相色谱法，对糖类化合物的分离度低，对极性大的物质难以准确定性和定量，实验室环境、操作者水平对实验结果影响较大。液相色谱-质谱法具有高灵敏度和高选择性，但其分析的样品需要进行纯化，不能实时监控反应情况。例如：王鸿超等人(高山被孢霉发酵产鸟苷酸二磷酸岩藻糖的研究[j].食品科技,2016,41(9):3；production of gdp-l-fucose bymortierella alpina fermentation[j].food science and technology,2016,41(9):3.)同时采用紫外-液相色谱法与质谱分析法对发酵产生gdp-l-岩藻糖的含量和纯度进行检测，该方法需要配置较高的离子交换柱来提高分离度，操作繁琐，且采用液相色谱-质谱分析需要提
2、专利技术目的
3、本专利技术的目的是提供一种简单、灵敏、准确、操作简便的gdp-l岩藻糖检测方法，该方法采用高效液相色谱-二极管阵列检测器进行检测，不仅能够提供光谱信息对gdp-l岩藻糖定性和定量分析，而且能够实时监控gdp-l-岩藻糖合成过程中的反应情况，为gdp-l-岩藻糖纯度、产率的提高和多功能fkp酶活性的筛选提供分析方法。
4、本专利技术提供的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测gdp-l-岩藻糖的方法包括下述步骤：
5、步骤1：制备gdp-l-岩藻糖供试品溶液。
6、步骤2：配制不同质量浓度的gdp-l-岩藻糖标准工作溶液。
7、步骤3：采用高效液相色谱对不同质量浓度的gdp-l-岩藻糖标准工作溶液进行检测，色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；向2.5～3.0g/l磷酸二氢钾水溶液中加入其质量0.2％～0.3％的四丁基溴化铵并用磷酸调节ph值为3.5～4.5后作为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器，洗脱程序为：0～5分钟：流动相b体积百分比为10％；5～25分钟：流动相b体积百分数比由10％升高至35％；25～28分钟：流动相b体积百分比由35％降低至10％；28～30分钟：流动相b体积百分比为10％；记录色谱峰面积，以gdp-l-岩藻糖标准工作溶液的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，建立gdp-l-岩藻糖的标准工作曲线，计算线性回归方程。
8、步骤4：按照步骤3的色谱条件对步骤1的gdp-l-岩藻糖供试品溶液进行检测，并结合步骤3的线性回归方程计算供试品溶液中gdp-l-岩藻糖的含量。
9、上述步骤1中，当实时监控gdp-l-岩藻糖合成过程中的反应情况时，所述供试品溶液的制备方法为：将腺嘌呤核苷三磷酸、鸟苷三磷酸与l-岩藻糖反应所得gdp-l-岩藻糖反应液在室温下静置5～10min后离心分离，取上层清液用水稀释后，用0.22μm过滤器过滤，取续滤液，得到供试品溶液。
10、上述步骤1中，当测试样品为生物样本(如血液、组织等)时，所述供试品溶液的制备方法为：将生物样本离心后，取上清液用甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，使gdp-l -岩藻糖从蛋白质等生物大分子中释放出来，再离心取上清液，获得供试品溶液。
11、上述步骤1中，当测试样品为食品或农产品样本时，所述供试品溶液的制备方法为：将食品或农产品样本粉碎后，用乙醇或水超声提取或加热回流提取gdp-l-岩藻糖，得到供试品溶液。
12、进一步，上述步骤3中，优选洗脱流速为0.8～1.2ml/min。
13、进一步，上述步骤3中，优选检测柱温为25～32℃。
14、进一步，上述步骤3中，优选检测波长为254±2nm。
15、本专利技术的有益效果如下：
16、1.优化样品前处理流程：本专利技术开发了独特的提取与纯化步骤，能有效去除复杂样品基质中的各类杂质，显著降低杂质对gdp-l-岩藻糖检测的干扰。与传统方法相比，大幅提高了目标物的纯度，进而提升检测准确性，为后续高效液相色谱分析提供了高质量的样品，从源头保障检测结果的可靠性。
17、2.系统的色谱条件优化：本专利技术全面且深入地对多种色谱条件进行优化。通过筛选不同类型、规格的色谱柱，精确调配流动相的组成与比例，并精准控制流速，实现了gdp-l-岩藻糖与其他共存物质的基线分离。获得的色谱峰峰形对称尖锐，极大提升了检测分辨率，使检测结果更为清晰准确，解决了传统方法中分离效果不佳的难题。
18、3.精准确定检测波长：本专利技术借助对gdp-l-岩藻糖光谱特征的深入研究，创新性地确定了最佳检测波长。这一举措显著增强了检测灵敏度，相较于未优化波长的检测方式，能够检测到更低浓度的目标物，拓宽了该方法的适用范围，尤其适用于痕量gdp-l-岩藻糖的检测。
19、4.宽线性范围与高灵敏度：本专利技术建立的分析方法展现出极宽的线性范围，涵盖从低至1.005μg/ml到高至21.100μg/ml的浓度区间，线性相关系数达0.9999以上，线性相关性良好。同时，检出限低至0.3μg/ml，在保证高灵敏度的同时兼顾了不同浓度样品的检测需求，在同类检测方法中具有显著优势。
20、5.出色的精密度与准确性：本专利技术方法的重复性实验相对标准偏差(rsd)小于0.05％，加标平均回收率为99.6％。这些数据表明该方法精密度良好，检测结果可靠稳定，准确性高，能够为科研、生产等领域提供值得信赖的检测数据。
21、6.高效快速检测：本专利技术成功将单次检测时间缩短至30min分钟以内，相较于传统检测方法，极大提高了检测效率。这不仅节省了时间成本，还能在单位时间内处理更多样品，满足现代科研和生产对高通量检测的需求，具有显著的实用价值。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为：将腺嘌呤核苷三磷酸、鸟苷三磷酸与L-岩藻糖反应所得GDP-L-岩藻糖反应液在室温下静置5～10min后离心分离，取上层清液用水稀释后，用0.22μm过滤器过滤，取续滤液，得到供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为：将生物样本离心后，取上清液用甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，使GDP-L -岩藻糖释放出来，再离心取上清液，获得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为：将食品或农产品样本粉碎后，用乙醇或水超声提取或加热回流提取GDP-L-岩藻糖，得到供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的基于
6.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤3中，检测柱温为25～32℃。
7.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测GDP-L-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤3中，检测波长为254nm。
...【技术特征摘要】
1.一种基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测gdp-l-岩藻糖的方法，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测gdp-l-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为：将腺嘌呤核苷三磷酸、鸟苷三磷酸与l-岩藻糖反应所得gdp-l-岩藻糖反应液在室温下静置5～10min后离心分离，取上层清液用水稀释后，用0.22μm过滤器过滤，取续滤液，得到供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的基于高效液相色谱-二极管阵列检测器定量检测gdp-l-岩藻糖的方法，其特征在于：步骤1中，所述供试品溶液的制备方法为：将生物样本离心后，取上清液用甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，使gdp-l -岩藻糖释放出来，再离心取上清液，获得供试品溶液。
...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。