【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了能够调控slc20a2基因的内含子中的可变剪接的试剂，及其用于调节功能性pit2蛋白的表达从而预防和/或治疗疾病的用途。本专利技术还提供了基于人slc20a2基因的内含子中的可变剪接的脑钙化模型及其制备方法，以及该模型用于指示和分析脑钙化病发病阶段、或用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型、或用于筛选药物的用途。
技术介绍
1、脑钙化是神经退行性疾病的一个标志，估计约有20-30％的老年人(年龄大于60岁)有脑钙化。原发性家族性脑钙化(pfbc)是一种老龄化相关的神经遗传病，其特点是双侧钙化沉积，主要在基底神经节、丘脑、小脑，有时在皮质下白质。pfbc发生在20-60岁，发病率为0.2％-0.6％，可能影响数以亿计的人，其中一半人可能表现出广泛的神经或心理症状，如头痛、帕金森病样运动缺陷、认知能力下降、焦虑和抑郁。目前，临床上只对pfbc患者进行对症治疗，如抗惊厥药、抗精神病药、抗抑郁药和控制帕金森病样症状的药物。双磷酸盐，一种主要用于骨质疏松症患者的焦磷酸盐类似物，曾被推测为通过抑制羟基磷灰石晶体介导的成核过程来缓解大脑钙化过程。然而，据报道，口服双磷酸盐仅在一小部分pfbc患者中显示出轻微和短暂的症状改善，并且没有观察到抑制钙化的效果。因此，pfbc患者对新疗法的需求尚未得到满足。
2、反义寡核苷酸(aso)是化学修饰核酸的单链聚合物，在许多神经系统疾病中表现出明显的疾病表型逆转。aso最普遍的功能是通过招募rnase-h介导的rna降解来沉默基因表达，如应用于肌萎缩性脊髓侧索硬化症、
3、然而在pfbc治疗领域中，尚未有通过调控slc20a2基因的剪接调控来抑制脑钙化的报道。
技术实现思路
1、遗传学研究发现，pfbc可能是由slc20a2、pdgfrb、pdgfb或xpr1的常染色体杂合突变或myorg、jam2或cmpk2的常染色体双等位突变引起的；特别的，slc20a2基因的显性杂合突变在所有已报道的pfbc病例中占比61％，表明pfbc可以通过针对相应基因的基因疗法进行治疗。然而，对pfbc致病机理的理解不足，以及缺乏有效的传递工具，很大程度上阻碍了pfbc的基因编辑治疗的发展。
2、本申请的专利技术人对135名经全外显子测序(wes)确定为外显子突变或cnv阴性的pfbc患者，进行了全基因组测序(wgs)，从6个常染色体显性遗传的pfbc家族中发现了5个slc20a2基因的内含子变异，并随后通过minigene检测和病人来源的细胞实验确定了slc20a2 pre-mrna的内含子序列存在隐蔽外显子序列，而上述内含子突变增加了这些隐蔽外显子序列在mrna加工过程中的整合概率；由于这些隐蔽外显子序列中包含了提前终止密码子，进而异常剪接的mrna序列不能翻译产生有功能的蛋白产物pit2。由此，本申请的专利技术人发现了一种因slc20a2 mrna异常剪接中先前未报告的隐蔽外显子插入而导致pit2翻译的提前终止，该种机制为调节slc20a2基因的mrna剪接和表达提供了一种新的策略。
3、基于上述发现，本申请的专利技术人在含有slc20a2内含子突变的细胞和来自slc20a2单倍体功能不足患者的成纤维细胞中，通过aso介导的剪接调控方法能够增强正常slc20a2mrna和pit2蛋白的表达。进一步在模拟slc20a2缺陷的pfbc患者的人源化slc20a2小鼠模型中，通过脑室内(icv)给药的aso能够减少异常slc20a2转录物并抑制脑钙化的发生和进展。
4、由此，本申请的专利技术人提供了通过调控slc20a2可变剪接过程，降低内含子中隐蔽外显子的整合来抑制脑钙化的疗法，为治疗pit2功能缺陷有关的疾病(例如slc20a2单倍体剂量不足导致的pfbc)提供了一种有希望的治疗方式。
5、此外，基于所发现的slc20a2内含子中的可变剪接，本申请的专利技术人进一步提供了脑钙化的细胞和动物模型及其制备方法，该模型可用于指示和分析脑钙化病发病阶段，用于作为研究脑内磷稳态失衡或脑钙化病疾病靶点的模型，以及用于筛选药物。
6、i、调控可变剪接在疾病治疗中的应用
7、在第一方面，本专利技术涉及调节slc20a2基因前体mrna的剪接从而恢复或增强slc20a2基因的蛋白产物pit2的表达和功能的试剂、方法和应用。
8、本专利技术的一个方面提供了能够调控slc20a2基因的内含子中的可变剪接的试剂用于在受试者中预防和/或治疗与pit2功能缺陷有关的疾病的用途；或者在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与pit2功能缺陷有关的疾病。本专利技术还提供了用于在受试者中预防和/或治疗与pit2功能缺陷有关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的能够调控slc20a2基因的内含子中的可变剪接的试剂。所述pit2功能缺陷包括表达量或活性缺乏。
9、在某些实施方案中，所述可变剪接包括隐蔽外显子插入(cryptic exoninclusion)，所述试剂调节(例如抑制或增强)所述隐蔽外显子从slc20a2基因的前体mrna中的剪接。在某些实施方案中，所述试剂由此调节(例如抑制或增强)从所述前体mrna加工的成熟mrna的水平，和/或调节(例如抑制或增强)pit2蛋白的表达。
10、在某些实施方案中，所述试剂抑制成熟slc20a2 mrna中所述隐蔽外显子插入，增加正确剪接的成熟slc20a2 mrna水平，降低异常剪接的成熟slc20a2 mrna水平，和/或增加功能性pit2蛋白的产生。在本文中，措辞“增加正确剪接的成熟slc20a2 mrna的水平”是指与处理之前或对照处理之后的水平相比，本专利技术提供的试剂处理之后正确剪接的成熟slc20a2 mrna的水平的增加。
11、在某些实施方案中，所述试剂促进成熟slc20a2 mrna中所述隐蔽外显子插入，抑制正确剪接的成熟slc20a2slc20a2 mrna水平，增加异常剪接的成熟slc20a2 mrna水平；其中，所述隐蔽外显子序列上携带有提前终止密码子(premature termination codon,ptc)，该隐蔽外显子的插入导致功能性pit2蛋白的产生的减少或抑制。在本文中，措辞“降低异常剪接的成熟slc20a2 mrna的水平”是指与处理之前或对照处本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述可变剪接包括隐蔽外显子插入(cryptic exoninclusion)，所述试剂调节(例如抑制或增强)所述隐蔽外显子从SLC20A2基因的前体mRNA中的剪接；
3.权利要求1-2任一项所述的用途，其中，所述可变剪接包括内含子2中的可变剪接；
4.权利要求1-2任一项所述的用途，其中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接；
5.权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述试剂特异性结合SLC20A2基因或其前体mRNA中的目标区域，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述隐蔽外显子；
6.权利要求5所述的用途，其中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其前体mRNA的c.289+801至c.289+1135的区域内；
7.权利要求5所述的用途，其中，所述目标区域位于SLC20A2基因或其
8.权利要求1-7任一项所述的用途，其中，所述试剂选自反义寡核苷酸(ASO)或基因编辑工具(例如CRISPR/Cas、碱基编辑器或非Cas蛋白依赖的RNA编辑工具)；
9.权利要求8所述的用途，其中，所述试剂是反义寡核苷酸(ASO)，其特异性结合SLC20A2前体mRNA中的所述目标区域；
10.权利要求8所述的用途，其中，所述试剂为基因编辑工具，例如DNA基因编辑系统或RNA碱基编辑工具；
11.权利要求1-10任一项所述的用途，其中，所述PiT2功能缺陷涉及SLC20A2基因中的突变；
12.权利要求1-11任一项所述的用途，其中，所述与PiT2功能缺陷有关的疾病受益于功能性PiT2蛋白或RNA表达的调控；
13.能够特异性结合SLC20A2基因或其前体mRNA中的目标区域的试剂，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有隐蔽外显子；
14.权利要求13所述的试剂，其中，所述试剂具备权利要求8-9任一项中定义的特征。
15.药物组合物，其包含权利要求13-14任一项所述的试剂或其组合，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.权利要求13-14任一项所述的试剂或权利要求15所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与PiT2功能缺陷有关的疾病；
17.权利要求16所述的用途，其中，所述受试者包含SLC20A2基因中的突变；
18.调节细胞中PiT2蛋白表达的方法，其包括在体外将能够调控SLC20A2基因的内含子中的可变剪接的试剂与所述细胞接触；
19.调节细胞中PiT2蛋白表达的方法，其包括在体外将权利要求13-14任一项所述的试剂与所述细胞接触；
20.鉴定能够调节细胞中PiT2表达的试剂的方法，所述方法包括：i)鉴定靶向PiT2基因或其前体mRNA中的目标区域的试剂，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有隐蔽外显子，所述目标区域在所述隐蔽外显子上游至多约100个核苷酸处至所述隐蔽外显子下游至多约100个核苷酸处的区域内；ii)将步骤i)中鉴定的试剂递送至所述细胞；和iii)测量步骤ii)的细胞中PiT2的mRNA和蛋白表达水平；
21.一种制备脑钙化模型的方法，其中，所述方法包括修饰目标基因组，使其内源SLC20A2基因的exon2和exon3之间的内含子序列全部或部分被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，或其内源SLC20A2基因的exon10和exon11之间的内含子序列全部或部分被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，其中所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段包含可改变SLC20A2基因剪接的突变，由此提供脑钙化模型；
22.经遗传修饰的细胞，其基因组包含：内源SLC20A2基因的exon2和exon3之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，或内源SLC20A2基因的exon10和exon11之间的内含子序列被人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段替换，其中所述人的SLC20A2基因相对应的内含子基因组片段包含可改变SLC20A2基因剪接的突变；
23.经遗传修饰的非人动物或细胞的用途...
【技术特征摘要】
1.能够调控slc20a2基因的内含子中的可变剪接的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与pit2功能缺陷有关的疾病。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述可变剪接包括隐蔽外显子插入(cryptic exoninclusion)，所述试剂调节(例如抑制或增强)所述隐蔽外显子从slc20a2基因的前体mrna中的剪接；
3.权利要求1-2任一项所述的用途，其中，所述可变剪接包括内含子2中的可变剪接；
4.权利要求1-2任一项所述的用途，其中，所述可变剪接包括内含子10中的可变剪接；
5.权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述试剂特异性结合slc20a2基因或其前体mrna中的目标区域，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述隐蔽外显子；
6.权利要求5所述的用途，其中，所述目标区域位于slc20a2基因或其前体mrna的c.289+801至c.289+1135的区域内；
7.权利要求5所述的用途，其中，所述目标区域位于slc20a2基因或其前体mrna的c.1795-1803至c.1795-1527的区域内；
8.权利要求1-7任一项所述的用途，其中，所述试剂选自反义寡核苷酸(aso)或基因编辑工具(例如crispr/cas、碱基编辑器或非cas蛋白依赖的rna编辑工具)；
9.权利要求8所述的用途，其中，所述试剂是反义寡核苷酸(aso)，其特异性结合slc20a2前体mrna中的所述目标区域；
10.权利要求8所述的用途，其中，所述试剂为基因编辑工具，例如dna基因编辑系统或rna碱基编辑工具；
11.权利要求1-10任一项所述的用途，其中，所述pit2功能缺陷涉及slc20a2基因中的突变；
12.权利要求1-11任一项所述的用途，其中，所述与pit2功能缺陷有关的疾病受益于功能性pit2蛋白或rna表达的调控；
13.能够特异性结合slc20a2基因或其前体mrna中的目标区域的试剂，所述目标区域位于两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有隐蔽外显子；
14.权利要求13所述的试剂，其中，所述试剂具备权利要求8-9任一项中定义的特征。
15.药物组合物，其包含权利要求13-14任一项所述的试剂或其组合，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.权利要求13-14任一项所述的试剂或权利要求15所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/或治疗与pit2功能缺陷有关的疾病；
17.权利要求16所述的用途，其中，所述受试者包含slc20a2基因中的突变；
18.调节细胞中pit2蛋白表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：程学文，陈万金，熊志奇，赵淼，陈蕾，曾一恒，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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