基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：1)信号单元LAP‑MXene@AuNPs‑ssDNA的制备；2)枪头传感界面的制备；3)测试液的制备；4)食源性致病菌的检测；采用低场核磁共振仪器测定不同浓度目标食源性致病菌条件下对应的低场核磁共振信号T2的强度，建立食源性致病菌浓度与T2信号变化值(ΔT2)的定量关系，根据该定量关系测定未知样品中食源性致病菌的浓度；优点是高高精密度以及高便捷性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及本专利技术涉及一种食源性致病菌的检测方法，尤其是涉及一种基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用。

技术介绍

1、致病菌是食品安全的一大问题，对致病菌的灵敏、准确、快速检测具有重要的公共卫生意义。除常规的平板计数方法外，目前出现了很多新型的方法：光谱方法如比色法、荧光法和表面增强拉曼散射法等；电化学方法如电化学、电化学发光和光电化学等；质谱法等。尽管上述方法在灵敏度、特异性和准确性方面显示良好的性能，但通常需要繁琐的样品预处理来消除复杂样品基质的信号干扰。相比之下，磁性材料很少出现在样品基质中，因此磁化学方法在抗干扰和无需样品预处理方面具有独特的优势。

2、磁弛豫开关(mrs)传感器利用低场核磁共振分析仪器进行信号输出，通过对水质子的弛豫分析来定量检测目标物，被广泛应用于生物大分子、农药残留、兽药残留以及致病菌等的检测。目前，大部分报道的mrs传感器通过磁性纳米颗粒对质子状态的间接影响以检测目标物，但由于磁性纳米颗粒可能存在非均相分散、易聚集等问题，影响检测结果的稳定性和重复性。利用均相体系中水质子状态变化检测，可以大大提高检测的精密度。最近已有利用目标物介导水凝胶的溶胶-凝胶转变直接调节水分子的弛豫行为，从而输出信号t2的生物传感策略。这启发我们利用水凝胶和溶胶之间的相转变，构建一种用于高精密度检测致病菌的均相mrs传感器。

3、本专利技术以移液枪头作为生物识别容器，在目标物的存在下，负载有大量酰基次磷酸锂lap的信号单元lap-mxene@aunps-ssdna从移液枪头内表面掉落并被注入检测液中。lap在紫外光照射下诱导检测液中水凝胶基质的二硫键断裂，使凝胶变为溶胶状态。通过检测凝胶-溶胶状态变化导致的弛豫时间变化，以实现对食源性致病菌的检测。本专利技术将生物识别反应过程置于枪头之中，简化了操作步骤，减小样品多次转移过程不可避免的操作误差，并且可以轻易实现高通量生物识别。此外，利用光控水凝胶的相转变作为信号输出，不仅与生物识别过程分离，还成功避免了常规mrs方法使用易自聚集的磁性材料而产生的非均相问题，有效提高了检测的精密度。目前，国内外还没有任何公开关于基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。

技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种精密度高且操作便捷的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用。

2、本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，包括以下步骤：

3、(1)信号单元lap-mxene@aunps-ssdna的制备

4、a.将40～120μl 0.1mol/l氯金酸haucl4溶液缓慢加入到2～12ml 1mg/ml mxene分散液中，避光搅拌40min，5000～6000×g离心分离，重新分散在2～12ml水中，即得mxene@aunps分散液。

5、b.将2～8mg苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐lap加入mxene@aunps分散液中，室温下摇晃4h，lap通过静电吸附结合在mxene上得到lap-mxene@aunps，离心洗涤数次，重新分散在2～8ml水中。

6、c.继续加入0.5～3ml 1od ssdna分散液，室温下搅拌5h，ssdna通过au-s键结合到lap-mxene@aunps上，离心洗涤数次后分散于2～8ml水中，得到信号单元lap-mxene@aunps-ssdna分散液。

7、(2)枪头传感界面的制备

8、a.移液枪头吸取接枝溶液，放置于紫外灯下照射，获得内表面羧基化的枪头。

9、b.将移液枪头内的羧基活化，并修饰适配体apt，进而连接lap-mxene@aunps-ssdna，以制备枪头传感界面。

10、(3)测试液的制备

11、将四臂巯基封端聚乙二醇4arm-peg-sh溶液、过氧化氢h2o2溶液和碘化钠nai溶液加入到1.5ml样品瓶中，室温下反应35min，获得测试液。

12、(4)食源性致病菌的检测

13、a.将待测样品吸入功能化的枪头中，在室温下孵育，随后将枪头内溶液注入测试液中并在紫外光照射后，进行t2测量。

14、b.在35℃下测定t2，参数如下：主频19.00mhz，采样频率100khz，射频延时0.5ms，等待时间5000ms，回波时间1.0ms，回波个数18000，累加次数2，数字增益3，模拟增益15.0db。δt2的值由以下公式计算：δt2＝t2(positive)–t2(negative)。其中，t2(negative)是无食源性致病菌时的平均t2，t2(positive)是有目标食源性致病菌时的平均t2。

15、进一步，步骤(2)a具体过程如下：将150～250mg二苯甲酮bp和3～7ml丙烯酸aa加入到4～8ml水中，充分摇匀后获得接枝溶液。用聚丙烯材质的移液枪枪头吸取0.5ml接枝溶液，擦干外表面残余液体后，放置于紫外灯(365nm，20w)下照射30min。之后将溶液排出，吸入足量甲醇后超声洗涤30min，去除多余物质。60℃下烘干，获得内表面羧基化的枪头。

16、进一步，步骤(2)b具体过程如下：将6～18mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc、4～10mg n-羟基琥珀酰亚胺nhs溶解于5ml水中，用0.01mol/l盐酸hcl调节ph＝5.0。使用羧基化的枪头吸取0.5ml上述溶液，室温下孵育2～4h以活化羧基。随后将液体排出并水洗，吸入0.5ml 0.5μm适配体apt，室温下孵育2h使apt的5′端氨基和枪头内表面活化的羧基发生偶联反应。将液体排出，吸入0.5ml 2wt％牛血清白蛋白bsa溶液在37℃下封闭非特异性结合位点0.5～2h，水洗三次。最后，吸入0.5ml lap-mxene@aunps-ssdna分散液，室温下反应1～3h，apt和ssdna通过杂交将信号单元固定在枪头的内表面，获得枪头传感界面。

17、进一步，步骤(3)具体过程如下：将0.5ml 1wt％四臂巯基封端聚乙二醇4arm-peg-sh溶液、0.01ml 0.5mol/l过氧化氢h2o2溶液和0.01ml 1mol/l碘化钠nai溶液加入到1.5ml样品瓶中，室温下反应35min，获得测试液。

18、进一步，步骤(4)a具体过程如下：将0.5ml待测样品吸入功能化的枪头中，在室温下孵育30～60min以使apt充分捕获目标物，将枪头内溶液注入测试液中，紫外光照射下反应10min后，进行t2测量。

19、进一步，所述的食源性致病菌选自副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌。

20、专利技术原理：本专利技术检测原理如图1所示，以副溶血性弧本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)a具体过程如下：将150～250mg二苯甲酮BP和3～7mL丙烯酸AA加入到4～8mL水中，充分摇匀后获得接枝溶液。用聚丙烯材质的移液枪枪头吸取0.5mL接枝溶液，擦干外表面残余液体后，放置于紫外灯(365nm，20W)下照射30min。之后将溶液排出，吸入足量甲醇后超声洗涤30min，去除多余物质。60℃下烘干，获得内表面羧基化的枪头。

3.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)b具体过程如下：将6～18mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC、4～10mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于5mL水中，用0.01mol/L盐酸HCl调节pH＝5.0。使用羧基化的枪头吸取0.5mL上述溶液，室温下孵育2～4h以活化羧基。随后将液体排出并水洗，吸入0.5mL 0.5μM适配体Apt，室温下孵育2h使Apt的5′端氨基和枪头内表面活化的羧基发生偶联反应。将液体排出，吸入0.5mL 2wt％牛血清白蛋白BSA溶液在37℃下封闭非特异性结合位点0.5～2h，水洗三次。最后，吸入0.5mL LAP-MXene@AuNPs-ssDNA分散液，室温下反应1～3h，Apt和ssDNA通过杂交将信号单元固定在枪头的内表面，获得枪头传感界面。

4.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(3)具体过程如下：将0.5mL 1wt％四臂巯基封端聚乙二醇4ARM-PEG-SH溶液、0.01mL 0.5mol/L过氧化氢H2O2溶液和0.01mL 1mol/L碘化钠NaI溶液加入到1.5mL样品瓶中，室温下反应35min，获得测试液。

5.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(4)a具体过程如下：将0.5mL待测样品吸入功能化的枪头中，在室温下孵育30～60min以使Apt充分捕获目标物，将枪头内溶液注入测试液中，紫外光照射下反应10min后，进行T2测量。

6.利用权利要求1-5中任一项制备方法得到的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于：所述的食源性致病菌选自副溶血性弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌。

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【技术特征摘要】

1.基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)a具体过程如下：将150～250mg二苯甲酮bp和3～7ml丙烯酸aa加入到4～8ml水中，充分摇匀后获得接枝溶液。用聚丙烯材质的移液枪枪头吸取0.5ml接枝溶液，擦干外表面残余液体后，放置于紫外灯(365nm，20w)下照射30min。之后将溶液排出，吸入足量甲醇后超声洗涤30min，去除多余物质。60℃下烘干，获得内表面羧基化的枪头。

3.根据权利要求1所述的基于光裂解水凝胶检测食源性致病菌的磁弛豫开关生物传感器的制备方法及其应用，本方法不以诊断或治疗为目的，其特征在于步骤(2)b具体过程如下：将6～18mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐edc、4～10mg n-羟基琥珀酰亚胺nhs溶解于5ml水中，用0.01mol/l盐酸hcl调节ph＝5.0。使用羧基化的枪头吸取0.5ml上述溶液，室温下孵育2～4h以活化羧基。随后将液体排出并水洗，吸入0.5ml 0.5μm适配体apt，室温下孵育2h使apt的5′端氨基和枪头内表面活化的羧基发生偶联反应。将液体排出，吸入0.5ml 2wt％牛血清白蛋白bsa溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭智勇，陈乐，史西志，张青青，郝婷婷，杨帆，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：