【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，更具体的说是涉及一种利用发根农杆菌高效获得花椒转基因毛状根的方法。
技术介绍
1、花椒作为我国重要的经济树种，在全国范围内有广泛的种植面积。其不仅是人们餐桌上的调味品，还具有优良的生物活性和医疗价值。但目前花椒育种周期较长，良种选育困难。因此，加快花椒育种以及缩短育种周期相关工作势在必行。
2、当前，花椒育种的方法主要以传统育种为主，繁殖方式主要以实生、嫁接、扦插为主。费希同证明了花椒属生殖方式为无融合生殖，间接证明了花椒无法通过杂交来获得新品种。而目前尚未鉴定出具有优良性状的花椒单倍体和多倍体品种。以组织培养为基本前提的根癌农杆菌介导基因育种，耗时过长，且实验流程繁琐。
3、综上，如何加快花椒育种以及缩短育种周期是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种利用发根农杆菌高效获得花椒转基因毛状根的方法。
2、本专利技术提出一种以花椒盆栽苗茎节为转基因外植体材料，发根农杆菌为转基因介质的方法，无需组培条件，大幅度减少工作量，可快速得到花椒转基因毛状根，为加速花椒育种提供参考依据。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种利用发根农杆菌高效获得花椒转基因毛状根的方法，包括如下步骤：
5、(1)表达载体构建；
6、(2)农杆菌转化；
7、(3)转基因受体制备—花椒茎节；
8、(4)外植体侵染；p>
9、(5)毛状根诱导；
10、(6)转基因毛状根植株移栽；
11、(7)转基因毛状根鉴定。
12、进一步的，所述步骤(1)为构建包含目的基因的表达载体；
13、所述表达载体为pbi121-egfp载体。
14、进一步的，步骤(2)中所述农杆菌为发根农杆菌msu440、发根农杆菌k599、发根农杆菌8196、发根农杆菌r1601或发根农杆菌c58c1。
15、进一步的，所述步骤(2)的具体操作为：将表达载体转化至农杆菌中，经液体扩大培养后离心、保留菌泥，之后将菌泥置于mes-koh悬浮液中，得侵染悬浮液；
16、所述mes-koh悬浮液包括如下组分：8～15mm mes一水合物，8～15mm mgcl2，0.02～0.05mm乙酰丁香酮，ph＝5.8～6.0。
17、进一步的，步骤(3)中所述花椒茎节为花椒3～5月龄盆栽苗枝条的带芽茎节。
18、进一步的，步骤(4)中所述侵染为浸泡或真空渗透。
19、进一步的，真空渗透的具体操作为：将花椒茎节置于侵染悬浮液中，0.02～0.05mpa压力下真空处理10～30min。
20、进一步的，所述步骤(5)的具体操作为：将侵染后的花椒茎节置于育苗盒中，育苗盒中放置40～60％湿度、3～5mm规格的蛭石。
21、进一步的，所述步骤(6)的具体操作为：将在育苗盒中生长30～50d的生根材料，转移至基质中继续培养。
22、进一步的，步骤(7)中所述鉴定包括荧光标记的鉴定、凝胶电泳鉴定和荧光定量鉴定。
23、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：
24、本专利技术通过室外培养以及真空渗透方式进行毛状根诱导，与现有技术中蚬壳花椒组培苗毛状根结果对比(陈新玲,王媛,孙吉康,等.蚬壳花椒毛状根的诱导及其培养技术体系构建)，转化率提高了27.8％，且无需经过组培诱导阶段，极大节约了工作量。
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1.一种利用发根农杆菌高效获得花椒转基因毛状根的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为构建包含目的基因的表达载体；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述农杆菌为发根农杆菌MSU440、发根农杆菌K599、发根农杆菌8196、发根农杆菌R1601或发根农杆菌C58C1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：将表达载体转化至农杆菌中，经液体扩大培养后离心、保留菌泥，之后将菌泥置于MES-KOH悬浮液中，得侵染悬浮液；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述花椒茎节为花椒3～5月龄盆栽苗枝条的带芽茎节。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述侵染为浸泡或真空渗透。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，真空渗透的具体操作为：将花椒茎节置于侵染悬浮液中，0.02～0.05MPa压力下真空处理10～30min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)的
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)的具体操作为：将在育苗盒中生长30～50d的生根材料，转移至基质中继续培养。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中所述鉴定包括荧光标记的鉴定、凝胶电泳鉴定和荧光定量鉴定。
...【技术特征摘要】
1.一种利用发根农杆菌高效获得花椒转基因毛状根的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为构建包含目的基因的表达载体；
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述农杆菌为发根农杆菌msu440、发根农杆菌k599、发根农杆菌8196、发根农杆菌r1601或发根农杆菌c58c1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：将表达载体转化至农杆菌中，经液体扩大培养后离心、保留菌泥，之后将菌泥置于mes-koh悬浮液中，得侵染悬浮液；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述花椒茎节为花椒3～5月龄盆栽苗枝条的带芽茎节。
...【专利技术属性】
技术研发人员：翟晓巧，王文君，任媛媛，王念，王星斗，何威，侯志华，
申请(专利权)人：河南省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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