【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，涉及一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系及试剂盒。
技术介绍
1、刚果热病毒(crimean congo hemorrhagic fever virus，cchfv)又称克里米亚-刚果出血热病毒，是一种蜱虫传播的烈性病毒，属于布尼亚病毒目(bunyavirales)，内罗病毒科(nairoviridae)，正内罗病毒属(orthonairovirus)。具有高度传染性，主要形成以蜱虫→动物→人，以及蜱虫→人→人的传播链。人感染会表现出严重出血并伴随多器官损伤性临床症状，临床主要表现为头痛、发热、呕吐、出血、休克等症状，严重时可导致死亡，病死率为10-40％。目前，刚果热病毒的实验室诊断主要有血清学诊断、分子生物学方法和病毒培养等方法。血清学检测技术主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验以及免疫层析技术。但间接免疫荧光法对实验室条件有一定要求，且操作过程较为繁琐，需要专业人员进行；酶联免疫吸附试验需要特定设备，且操作过程需要严格控制以避免假阳性或假阴性结果；免疫层析技术灵敏度及特异性较低。分子生物学检测技术主要包括实时荧光定量pcr以及核酸测序等技术，其需要昂贵且精密的设备，且操作过程复杂，成本高昂，耗时长，不适合用于临床快速诊断；而病毒培养对实验室条件要求较高且耗时长。
2、裂谷热病毒(rift valley fever virus，rvfv)是一种单股负链rna病毒，属于布尼亚病毒目、白纤病毒科、白蛉病毒属。裂谷热(rift valley fever，rvf
3、尼帕病毒(nipah virus，niv)是副粘病毒科的一种高致病性人兽共患烈性病毒，为rna病毒，被划分为生物安全等级4级病毒。其天然宿主是蝙蝠(尤其是果蝠)，中间宿主包括猪、马、猫、狗等易感动物，同时niv具有人传人的能力，人感染后通常表现为急性脑炎和呼吸道疾病症状，致死率高。尼帕病毒的实验室诊断方法主要分为血清学诊断方法和分子学诊断方法。传统的血清学诊断方法主要包括酶联免疫吸附测定和血清中和试验。
4、亨德拉病毒(hendra virus，hev)原称为马麻疹病毒，是一种高致死性的人兽共患烈性病毒，被列为生物安全四级病毒。其被归为副黏病毒科、亨尼帕病毒属。与其他副黏病毒科病毒相比，hev具有宿主范围广、无血凝特性和神经氨酸酶活性等特点。狐蝠科的果蝠被认为是hev的自然宿主，其感染或携带病毒却不表现发病。人类感染hev可导致致死性呼吸道或脑炎疾病及广泛的血管炎症，据调查显示其致死率可达40～75％。当前，hev常用的实验室诊断技术包括：病原学检测、免疫学检测和分子生物学检测等。最初使用血清中和实验对hev进行初步监测，但感染动物大多死亡于产生有效免疫应答之前，因此该方法不适于hev感染的初期检测。病原学诊断为临床上确诊疾病的金标尺，从感染动物体内分离培养hev可最大限度上辅助诊断。然而由于hev对实验室基础设施、操作人员熟练程度要求高、病原分离缓慢困难等限制因素，当前很多地区难以实现用病毒分离培养方法，满足临床检测需求。elisa成本低廉，特异性强，灵敏度高，在临床检测的推广度较高，但特异度较低且导致频繁的假阳性和非特异性反应。
5、crispr/cas体系由成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(cas，crispr-associated proteins)组成。自然界crispr/cas体系依据其结构特征和遗传内容分为两大类(1类和2类)。根据效应蛋白功能、作用方式和结构，这些类别又分为六种类型(i至vi)和33个亚型。1987年，crispr序列结构首次被发现；随后，研究者发现该体系出现在超过50％细菌和90％古菌中。随着研究深入，该体系在分析检测领域也潜力巨大。其用于分析检测，具有生理温度下识别目标物、特异性好、灵敏度高、操作简单、响应速度快、成本低廉、易于微型化和集成等优点，特别适用于复杂实际样本中低丰度靶标分子检测和poct诊断部署。其中，cirspr/cas3、crispr/cas9、crispr/cas12、crispr/cas13及crispr/cas14体系是用于分析检测的常见体系，通常cas12a蛋白用于双链dna检测、cas13蛋白用于rna检测，cas14蛋白用于单链dna检测。
6、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)因为检测便捷，敏感性高，以及冻干试剂的商业可用性，该方法已在实验室外、偏远地区以及在板载自动样品中应用。rpa反应原理从重组酶与引物结合开始，在加载因子的辅助下形成了一个核蛋白细丝，形成的复合物在双链dna中搜索目的同源序列。一旦定位到目的同源序列，复合体就侵入双链dna，形成d环结构以启动链交换反应，而未缠绕的链被单链结合蛋白稳定。一旦进行链交换，重组酶就会从核蛋白丝上分解，并可用于下一对引物。接下来，dna聚合酶从引物的3'端延伸。随着扩增的继续，两个亲本链开始分离并最终形成另外两个亲本链，然后重复整个过程。
7、crispr/cas系统与rpa扩增相结合建立核酸检测方法，可以提高敏感性和特异性，从而达到快速、敏感、简便的临床快速检测需求。目前，还未见有应用rt-rpa和crispr/cas12a技术对以上四种烈性病毒进行检测和诊断的报道。
技术实现思路
1、为了克服四种烈性病毒现有检测技术的不足，本专利技术提供了一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系、试剂盒及试剂盒使用方法，可实现对四种烈性病毒rna的逆转录恒温扩增及crispr/cas12a一体化的可视化检测。
2、为实现其目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供了一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述烈性病毒为刚果热病毒、裂谷热病毒、尼帕病毒或亨德拉病毒；所述检测体系包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas12a反式切割检测体系；
2.如权利要求1所述的一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反式切割检测体系中含crRNA(500nM)2μL，还包括：
3.根据权利要求2所述的一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述RT-RPA等温扩增体系中含正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，还包括：
4.一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas12a反式切割检测体系。
5.如权利要求4所述的一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快
6.根据权利要求5所述的一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤S1中，RT-RPA等温扩增条件为：39℃水浴反应30min。
7.根据权利要求6所述的一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的烈性病毒核酸快速检测试剂盒的使用方法，所述步骤S2中，反应条件为：25℃预热1min，1个循环；37℃反应30s，60个循环，且每个循环采集一次FAM荧光通道的荧光信号。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述烈性病毒为刚果热病毒、裂谷热病毒、尼帕病毒或亨德拉病毒；所述检测体系包括rt-rpa等温扩增体系和crispr/cas12a反式切割检测体系；
2.如权利要求1所述的一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述crispr/cas12a反式切割检测体系中含crrna(500nm)2μl，还包括：
3.根据权利要求2所述的一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快速检测体系，其特征在于，所述rt-rpa等温扩增体系中含正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，还包括：
4.一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的烈性病毒核酸快...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱启运，杨鹏飞，徐帅，凌东奇，柳煊博，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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