【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及氟代5-羟基色氨酸生物传感器及检测试剂。
技术介绍
1、5-羟基色氨酸(5-htp)是动物体内合成血清素与褪黑素的前体，它们对情绪与行为的控制，以及睡眠、痛觉、体温等生理功能具有重要的调节作用，并且已经被成功地用于抑郁症、失眠和偏头痛等疾病的治疗。氟原子引入到5-htp中会有增强药效的功能，例如4f-5htp,6f-5htp,7f-5htp等。目前氟代5htp的合成采用色氨酸羟化酶(tph145)催化氟代l-色氨酸的羟化反应，其中fe2+和四氢生物蝶呤(bh4)为辅因子，o2为共底物，摇瓶放大反应4f-5htp的产量可达约1.2g/l。但要想进一步提高羟化酶活力，需要构建特异性识别4f-5htp的高通量筛选方法。
2、目前氨基酸类物质的高通量筛选大多是采用生物传感器的方式，robert t.batey等报道了特异性识别5htp的生物传感器，但是当其检测含氟5htp时检测性能表现不佳。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供4f-5htp生物传感器及检测试剂。
2、本专利技术提供的氟代5-羟基色氨酸rna的适配体，自5’端至3’端依次为trna支架1，dfhbi-1t的适配体1、连接模块1、氟代5-羟基色氨酸的适配体、连接模块2、dfhbi-1t的适配体2，trna支架2；
3、其中：
4、trna支架1具有seq id no:1所示的核酸序列；
5、trna支架2具有se
6、dfhbi-1t的适配体1具有seq id no:3所示的核酸序列；
7、dfhbi-1t的适配体2具有seq id no:4所示的核酸序列；
8、氟代5-羟基色氨酸的适配体具有seq id no:5所示的核酸序列；
9、连接模块1和连接模块2独立地选自ta、tat、tata或tatat。
10、本专利技术提供的适配体可以为dna或rna，本专利技术对此不做限定。在本专利技术的序列表中，将其表征为dna形式，相应的，其rna形式即为将dna序列中的t转变为u。本专利技术将所述适配体的dna序列链接入重组质粒中，然后在宿主体内转录为rna。
11、本专利技术对适配体中的连接模块进行了筛选和优化，结果表明，四种连接木块中，tata或tatat用于连接氟代5-羟基色氨酸的适配体和dfhbi-1t的适配体能够获得更强烈的荧光反应，与其他连接模块产生的荧光强度存在显著性差异，从而使检测更灵敏、准确。其中，tata的效果更优。
12、本专利技术中，所述氟代5-羟基色氨酸为氟原子取代的5-羟基色氨酸，包括4-氟-5-羟基色氨酸、6-氟-5-羟基色氨酸、7-氟-5-羟基色氨酸、4,6-二氟-5-羟基色氨酸。针对不同的5-羟基色氨酸，采用的适配体相同，该适配体能够区分氟代5-羟基色氨酸和色氨酸。具体实施例中，所述适配体的其核酸序列如seq id no:8或seq id no:9所示。
13、本专利技术还提供了一种重组质粒，其包括如前所述的适配体。
14、本专利技术实施例中，所述重组质粒的骨架载体为petduet-1。
15、进一步的，本专利技术还提供了一种感应菌，其包括如前所述的重组质粒1。
16、具体实施例中，本专利技术所述的感应菌的宿主为大肠杆菌。
17、更进一步的，本专利技术还提供了一种试剂，其包括如前所述的感应菌、荧光染料dfhbi-1t、镁离子和反应缓冲液。
18、本专利技术中，所述试剂中的反应缓冲液为pbs缓冲液或m9缓冲液，所述镁离子的浓度为1～10mm，所述荧光染料dfhbi-1t的浓度为1～10mm。
19、一些实施例中，所述镁离子的浓度为5mm，所述荧光染料dfhbi-1t的浓度为5mm。
20、实验表明，未经破碎的感应菌用于定量检测的检测时间为1～4h。而破碎后的感应菌细胞与生产菌最佳融合时间测定0～12h，优选为0.5h。作为优选，本专利技术所述试剂中，所述感应菌经过破碎。
21、更进一步的，如前所述试剂的制备方法，包括：将如前所述的重组质粒转化入大肠杆菌，培养后与荧光染料dfhbi-1t、镁离子和缓冲液混合后破碎菌体。本专利技术中，所述培养的步骤包括营养培养和诱导培养，所述诱导培养的时间为2～6h。
22、更进一步的，本专利技术还提供了如前所述的试剂在制备具有如下(a1)～(a4)中的至少一种功能的试剂盒中的应用：
23、(a1)氟代5-羟基色氨酸含量的检测；
24、(a2)色氨酸羟化酶活性的检测；
25、(a3)色氨酸羟化酶的性能筛选；
26、(a4)色氨酸羟化酶的定向进化筛选。
27、更进一步的，本专利技术提供了氟代5-羟基色氨酸含量检测的试剂盒，其包括：如前所述的试剂。
28、相应的，本专利技术还提供了氟代5-羟基色氨酸含量检测的方法，其包括以如前所述的试剂盒对待测样品中进行检测，根据荧光强度判断氟代5-羟基色氨酸的含量。
29、本所述氟代5-羟基色氨酸含量的检测方法中，待测样本中4f-5htp的含量的确定包括：构建荧光值与氟代5-羟基色氨酸含量的标准曲线方程，然后将待测品所测定的荧光值代入标准曲线方程，从而计算所述待测样本中4f-5htp的含量。
30、所述方法中，检测波长为发射光ex:480～620nm；激发光ex:400～520nm范围。通过全波长扫描得到了其荧光检测的最佳波长为激发光ex:472nm，发射光em:520nm，该波长满足通用的绿色荧光蛋白的波长检测范围,易于检测。
31、实验表明，未经破碎的感应菌用于定量检测的检测时间为1～4h。而感应菌细胞(破碎、未破碎)与生产菌最佳融合时间测定0～12h。
32、作为可行性案例，氟代5-羟基色氨酸含量的检测方法包括如下步骤：荧光酶标板中总检测体积为100μl，分别为89μl4f-5htp感应菌超声破碎后的上清(含有5mm mgso4)；10μl待检测样品上清；1μl荧光染料dfhbi-1t溶于dmso，终浓度50μm。thermo fisher酶标仪的激发光参数设置为ex：472nm；发射光参数设置为em：520nm，增益参数设置50，在3h时刻进行荧光检测。
33、本专利技术中，所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的待测4f-5htp标准品溶液进行检测，测得各浓度的标准品溶液对应的荧光值，从而获得4f-5htp的浓度与荧光值之间的标准曲线方程。
34、更进一步的，本专利技术提供了色氨酸羟化酶的活性检测、性能筛选或定向进化筛选试剂盒，其包括如前所述的试剂和氟代5-羟基色氨酸的生产菌；
35、所述氟代5-羟基色氨酸的生产菌中tnaa基因被敲除，且转化有重组质粒2和重组质粒3；
36、所述重组质粒2中包括编码待测色氨酸羟化酶的核酸片段；<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.氟代5-羟基色氨酸RNA的适配体，自5’端至3’端依次为tRNA支架1，DFHBI-1T的适配体1、连接模块1、氟代5-羟基色氨酸的适配体、连接模块2、DFHBI-1T的适配体2，tRNA支架2；
2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9所示。
3.重组质粒，其包括权利要求1或2所述的适配体。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，其骨架载体为pETDuet-1。
5.感应菌，其包括权利要求3或4所述的重组质粒1。
6.根据权利要求5所述的感应菌，其特征在于，其宿主为大肠杆菌。
7.试剂，其包括权利要求5或6所述的感应菌、荧光染料DFHBI-1T、镁离子和反应缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述反应缓冲液为PBS缓冲液或M9缓冲液，所述镁离子的浓度为1～10mM，所述荧光染料DFHBI-1T的浓度为1～10mM。
9.根据权利要求7或8所述的试剂，其特征在于，所述感应菌经过破碎。
1
11.权利要求7～10任一项所述的试剂在制备具有如下(a1)～(a4)中的至少一种功能的试剂盒中的应用：
12.氟代5-羟基色氨酸含量检测的试剂盒，其包括：权利要求7～10任一项所述的试剂。
13.氟代5-羟基色氨酸含量检测的方法，其包括以权利要求12所述的试剂盒对待测样品中进行检测，根据荧光强度判断氟代5-羟基色氨酸的含量。
14.色氨酸羟化酶的活性检测、性能筛选或定向进化筛选试剂盒，其包括权利要求7～10任一项所述的试剂和氟代5-羟基色氨酸的生产菌；
15.色氨酸羟化酶和/或色氨酸脱羧酶的活性检测、性能筛选或定向进化筛选的方法，其包括：将待测色氨酸羟化酶和/或色氨酸脱羧酶的编码核酸片段连接入重组质粒2，然后与重组质粒3一同转化入tnaA基因被敲除的宿主中，获得生产菌。
...【技术特征摘要】
1.氟代5-羟基色氨酸rna的适配体，自5’端至3’端依次为trna支架1，dfhbi-1t的适配体1、连接模块1、氟代5-羟基色氨酸的适配体、连接模块2、dfhbi-1t的适配体2，trna支架2；
2.根据权利要求1所述的适配体，其特征在于，其核酸序列如seq id no:8或seq idno:9所示。
3.重组质粒，其包括权利要求1或2所述的适配体。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，其骨架载体为petduet-1。
5.感应菌，其包括权利要求3或4所述的重组质粒1。
6.根据权利要求5所述的感应菌，其特征在于，其宿主为大肠杆菌。
7.试剂，其包括权利要求5或6所述的感应菌、荧光染料dfhbi-1t、镁离子和反应缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述反应缓冲液为pbs缓冲液或m9缓冲液，所述镁离子的浓度为1～10mm，所述荧光染料dfhbi-1t的浓度为1～10mm。
9.根据权利要求7或8所述的试剂，其...
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