一种用于纠正F9基因异常mRNA剪接的U1-snRNA及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于纠正F9基因异常mRNA剪接的U1‑snRNA及其应用。本发明专利技术提供了U1‑snRNA表达载体，U1snRNADEL载体，针对F9基因5号外显子的特异性U1‑snRNA载体pU1Ex5，F9基因第五号外显子剪接分析报告载体F9‑E5‑WT质粒，F9‑E5‑c.520+13A>G剪接报告载体的构建方法，还提供了将所述F9‑E5‑c.520+13A>G剪接报告载体构建成功后，使用人胚胎肾293T细胞进行迷你基因的表达研究，或将所述F9‑E5‑c.520+13A>G剪接报告载体用于制备治疗由mRNA剪接异常引发的各类疾病的药物或试剂盒。本发明专利技术基于小核RNA在mRNA剪接中的作用机制，通过定点突变技术，精确设计出针对特定突变位点的U1‑snRNA，这一原理为基因突变引发的异常剪接问题提供了一种创新的解决方案，具有广泛的应用前景，尤其是在血友病B等遗传性出血性疾病的基因治疗中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，尤其是涉及一种用于纠正f9基因异常mrna剪接的u1-snrna及其应用。

技术介绍

1、血友病b是一种由f9基因编码的凝血因子ix(coagulation factor ix，fix)缺陷引起的x连锁隐性出血性疾病。血友病b患者由于fix含量或者功能不足，容易发生不同程度的出血，尤其是在关节和肌肉部位。反复出血可导致关节损伤、关节炎及残疾，甚至轻微的创伤也可能引发难以控制的出血。严重情况下，患者可能发生内出血或脑出血，威胁生命。随着病情的进展，患者的生活质量显著下降，日常活动受限。血友病b在男性中的发病率约为1/3000，患者的临床表现和病情严重程度与f9基因的突变类型密切相关。f9基因的突变形式包括错义突变、无义突变、同义突变、内含子突变、基因缺失、重复及插入突变等。目前数据库中已报道超过1600种f9基因突变，其中内含子突变可能导致异常mrna剪接，严重影响fix的含量或功能。

2、当前，血友病b的主要治疗方式是fix替代疗法，但该疗法无法直接解决患者自体fix含量或活性无法恢复正常的问题。长期使用替代疗法不仅成本本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种U1-snRNA表达载体，其特征在于，为U1-snRNA片段通过BamH I酶切位点插入到pSP64载体后得到的野生型U1-snRNA表达载体，其中U1-snRNA基因目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种U1snRNADEL载体，其特征在于，其是以U1-snRNA表达载体为模板，定点突变去除U1-snRNA质粒Bcl I和Bgl II酶切位点之间的序列所得到的新的载体，所述U1snRNADEL载体的序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种权利要求2所述的U1snRNADEL载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

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【技术特征摘要】

1.一种u1-snrna表达载体，其特征在于，为u1-snrna片段通过bamh i酶切位点插入到psp64载体后得到的野生型u1-snrna表达载体，其中u1-snrna基因目的片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.一种u1snrnadel载体，其特征在于，其是以u1-snrna表达载体为模板，定点突变去除u1-snrna质粒bcl i和bgl ii酶切位点之间的序列所得到的新的载体，所述u1snrnadel载体的序列如seq id no.6所示。

3.一种权利要求2所述的u1snrnadel载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种针对f9基因5号外显子的特异性u1-snrna载体pu1ex5，其特征在于，以权利要求2所述u1snrnadel载体为模板，用定点突变试剂盒进行定点突变，将结合序列tatgacctg插入到u1snrnadel载体的bcl i和bgl ii酶切位点之间，得到pu1ex5质粒。

5.一种如权利要求4所述针对f9基因5号外显子的特异性u1-snrna载体pu1ex5的构建方法，其特征在于，以权利要求2所述u1snrnadel载体为模板，用定点突变试剂盒进行定点突变，将结合序列tatgacctg插入到u1snrnadel载体的bcl i和bgl ii酶切位点之间，得到pu1ex5质粒，其中定点突变引物分别为如seq id no.7所示和如seq id no.8所示。

6.一种f9基因第五号外显子剪接分析报告载体f9-e5-wt质粒的构建方法，其特征在于，以质粒ptb模板，将f...

【专利技术属性】
技术研发人员：张华阳，郭玮，王蓓丽，潘柏申，顾梅秀，王冲，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：