【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体的涉及一种血小板标志物检测试剂及检测方法。
技术介绍
1、血小板相关抗体检测通常采用流式细胞仪法，检测血小板表面膜糖蛋白阳性率以及血小板活化标志物的阳性率。膜糖蛋白cd41/cd61/42a/cd42b表达的减少或缺失，提示先天性或获得性的血小板功能缺陷，会造成出血风险增大。cd62p的测值可反映血小板活化的程度，活化是血栓形成的起始原因，测值越高显示活化程度越高，则血栓风险越高。血小板-白细胞聚集体的测值，可评估感染患者的细胞免疫状态，测值越高提示细菌或病毒感染的进展；结合cd62p的测值，可共同评估感染患者的血栓风险，测值越高则风险越高。在使用抗板药物的过程中，需要定期动态监测血小板活化等指标，评估缺血或出血的风险，从而帮助临床实现个体化用药。
2、流式细胞术是近些年发展起来的新技术，能够对一个样本进行多参数高通量检测，检测速度快、精度高、准确性好。微量样本多指标流式蛋白定量技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测，是流式细胞术的进阶版，利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒-“捕获微球-待测物-检测抗体夹心复合物”所散发的荧光，从而测定待测物的数量，这种方法对样本需求量更少，检测更快速、更准确。
3、由于一般血液中的红细胞的数量比血小板多几十倍，如果不去除红细胞，上流式细胞仪检测时，会影响对血小板的检测。目前的方法基本采用传统的红细胞裂解法裂解红细胞，裂解处理会影响血小板的活化状
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种不影响血小板的活化状态的检测血小板标志物的检测试剂及检测方法，用来解决现有技术中的缺点，实现更准确的检测结果。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种血小板标志物检测试剂，包括荧光标记抗体和磷酸盐缓冲液。
4、本专利技术中所述的荧光标记抗体为抗cd41、cd42a、cd42b、cd61、cd62p、cd63，或其他血小板标志物的荧光标记抗体。即本专利技术的检测试剂根据所含荧光标记抗体种类不同，可用于检测cd41、cd42a、cd42b、cd61、cd62p、cd63，或其他血小板标志物。
5、利用本专利技术的血小板标志物检测试剂检测血小板标志物的方法，包括以下步骤：
6、1)在流式管底部加入血液样本，避免血液样本碰到管壁；
7、2)向流式管中加入荧光标记抗体试剂；
8、3)轻轻涡旋震荡混匀并在室温下避光孵育；
9、4)避光固定静置；
10、5)静置后离心去除红细胞，转移上清液到新的试管，上流式细胞仪检测。
11、进一步优化的方案，本专利技术的检测血小板标志物的方法，包括以下步骤：
12、1)在流式管底部加入5μl血液样本，避免血液样本碰到管壁；
13、2)向流式管中加入5μl荧光标记抗体试剂；
14、3)轻轻涡旋震荡混匀并在室温下避光孵育10-40分钟；
15、4)加入0.5-0.8ml含多聚甲醛的pbs缓冲液，避光固定静置10-40min；
16、5)离心10-1000g，2-20分钟，转移上清液到新的试管，上流式细胞仪检测。
17、进一步要求的，所采用的血液样本细胞浓度为100×108/l-280×109/l。
18、进一步要求的，所采用的血液样含有柠檬酸抗凝剂。
19、进一步要求的，在运行流式细胞仪检测之前，上清液低速涡旋震荡充分混匀。
20、进一步要求的，流式细胞仪分析，首先建立fsc/ssc散点图，圈出血小板，然后选择血小板，建立标志物/ssc散点图，圈出标志物阳性血小板。
21、进一步的，本专利技术中的荧光标记抗体试剂采用别藻蓝蛋白为载体的荧光标记抗体试剂。具体的，可以采用纯化的血小板标志物单克隆抗体与纯化的别藻蓝蛋白采用氨基peg4叠氮偶联获得。具体为，纯化的血小板标志物单克隆抗体、纯化的别藻蓝蛋白、氨基peg4叠氮按摩尔：1：4：25的比例混合均匀，室温50-100w超声处理三次，依次30s、间隔静置10min、30s，间隔静置10min，20s，继续静置反应20-30min，分离纯化获得血小板标志物-apc荧光标记抗体。
22、本专利技术的工作原理及有益效果为：本专利技术采用荧光抗体染色后，通过离心方法除掉红细胞，相对于传统的裂解方法，既能够除掉红细胞，又不会影响血小板及其活化状态，能够获得更加准确的检测结果。
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1.一种血小板标志物检测试剂，其特征在于：包括荧光标记抗体和磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述荧光标记抗体为抗CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD62p、CD63，或其他血小板标志物的荧光标记抗体。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂检测血小板标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所采用的血液样本细胞浓度为100×108/L-280×109/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所采用的血液样含有柠檬酸抗凝剂。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在运行流式细胞仪检测之前，上清液低速涡旋震荡充分混匀。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，流式细胞仪分析，首先建立FSC/SSC散点图，圈出血小板，然后选择血小板，建立标志物/SSC散点图，圈出标志物阳性血小板。
【技术特征摘要】
1.一种血小板标志物检测试剂，其特征在于：包括荧光标记抗体和磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述荧光标记抗体为抗cd41、cd42a、cd42b、cd61、cd62p、cd63，或其他血小板标志物的荧光标记抗体。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂检测血小板标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶堂元，梁东，
申请(专利权)人：贵州中元生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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