【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种非血红素铁酶突变体、截短体以及在合成手性伯胺化合物中的应用，属于酶工程领域。
技术介绍
1、手性伯胺广泛存在于生物活性分子中，广泛应用于天然产物、药物分子以及农用化学品的合成中，是常见药物分子中间体的重要结构。手性伯胺通常包含一个氨基（nh2）和一个手性中心，手性中心可以是碳原子、氮原子或其他类型的原子，通常与不同的取代基相连。其中，与生物功能有关的重要化合物多数为杂环化合物，例如核酸、维生素、抗生素、激素、色素和生物碱等。在同时含硫和氮的杂环化合物中，噻唑骨架是药物开发的重要特征结构之一。例如，2-氨基噻唑啉常存在于胆碱受体调节剂、一氧化氮合酶抑制剂和抗菌化合物中（ organic letters, 2010, 12, 5526-5529）。
2、目前，2-氨基噻唑啉的合成主要是通过2-羟乙基硫脲的转化，但现有方法多采用有机催化的合成途径，存在明显不足。例如2-羟乙基硫脲的脱水环化，在强酸催化的条件下难以兼容对酸不稳定或易于发生酸催化外消旋化的底物（ journal of fluorine chemistry, 2005, 126, 297-300）。而光延反应的条件虽然相对温和，但常得到2-氨基咪唑啉和1,2-亚乙基硫脲的混合产物（ bioorganic&medicinal chemistry le
3、专利技术专利cn202010771036.5公开了可在有机溶剂或水中，有氧氛围下，以酮和硫脲或硫脲衍生物为原料，在活性炭或金属盐共同催化下，通过缩合/氧化偶联反应得到目标产物。专利技术专利cn202110616891.3采用电化学合成方法，以酮和硫脲为原料，二甲基亚砜和水为溶剂，卤化铵或碱金属卤化物同时作为电解质和电催化剂，在添加剂存在条件下，反应温度50-90℃，得到2-氨基噻唑类化合物。以上技术方案虽然实现了一步构建噻唑环，但均未能得到手性的2-氨基噻唑类化合物，且所用反应体系对环境污染严重。
4、烯烃的双官能团化反应具有良好的原子和步骤经济性，可在碳碳双键的两侧同时引入新的官能团。morandi课题组发展了一系列铁催化烯烃的氨基官能团化反应来获得卤素（ science, 2018, 362, 434-439）、羟基（ angewandte chemie international edition,2016, 55, 2248-2251）和叠氮（ journal of the american chemical society, 2020, 142,21548-21555）等官能团取代的伯胺产物。该反应逐渐成为有机合成中提高分子复杂性的有力工具，显示出巨大的工业应用潜力。
5、酶催化反应具有高效性、高选择性和绿色环保等特点，在化工、能源和材料等领域得到了广泛的应用。基于过渡金属催化的相关研究，arnold课题组改造了一种耐热含铁酶细胞色素c（ angewandte chemie international edition, 2019, 58, 3138-3142），它可在无氧条件下，利用羟胺衍生物作为氮源，直接将烯烃转化为具有高对映选择性且未保护的2-氨基-1-醇。该方法补充了传统化学合成中缺少的高对映选择性转化途径，但该方法只提供了邻位羟基取代的伯胺化产物，对于酶催化烯烃的氨基官能团化的适用范围未进行充分探讨，且该方法利用酶活性中心的血红素形成稳定的配位结构，底物特异性较强，通常只能催化特定反应，从而限制了该类酶的适用性。
6、综上所述，本专利技术拟发展一种工程酶，可催化烯烃的氨基官能团化反应，实现更加经济、绿色的手性伯胺化合物的不对称合成，并进一步发展其在工业上的适用性。
技术实现思路
1、非血红素铁酶主要包括羟化酶和卤化酶两种，其天然催化机理如下：该类酶活性中心的铁一般与两个组氨酸和一个谷氨酸或天冬氨酸配位，如果是卤化酶，则该位置则由水配位，当加入α-kg，卤素离子和底物后，α-kg和卤素离子将取代水分子而与铁配位。在氧气存在下，可形成过氧自由基，再脱去一分子co2，得到具有高反应活性的高价铁氧中间体。随后通过攫取底物氢原子和羟基自由基反弹，实现羟基化反应，或者捕获卤素自由基，实现卤化反应。非血红素含铁酶相较于血红素铁酶，具有多个开放的铁配位位点，具有高度灵活和可调的反应活性，有望成为扩展烯烃的氨基官能团化反应多样性的有力候选者。
2、本专利技术提供了一种非血红素铁酶突变体，它是将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型非血红素铁酶 bsqued，第234位，236位和275位的组氨酸突变为丙氨酸得到；其氨基酸序列如seq id no.3所示。
3、本专利技术提供了一种非血红素铁酶截短体，它是对所述的非血红素铁酶突变体进行截短，得到非血红素铁酶截短体 bsqued174ptt，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
4、本专利技术还提供了所述的非血红素铁酶截短体突变体，它是以非血红素铁酶截短体 bsqued174pt为亲本，发生突变得到的突变体：
5、将亲本第71位异亮氨酸突变为缬氨酸，得到突变体 bsqued174pt-i71v；
6、将亲本第71位异亮氨酸突变为亮氨酸，得到突变体 bsqued174pt-i71l；
7、将亲本第116位丝氨酸突变为精氨酸，得到突变体 bsqued174pt-s116r；
8、将亲本第116位丝氨酸突变为赖氨酸，得到突变体 bsqued174pt-s116k；
9、将亲本第118位苏氨酸突变为组氨酸，得到突变体 bsqued174pt-t118h；
10、将亲本第11本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非血红素铁酶突变体，其特征在于：它是将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型非血红素铁酶BsQueD，第234位，236位和275位的组氨酸突变为丙氨酸得到；其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种非血红素铁酶截短体，其特征在于：它是对权利要求1所述的非血红素铁酶突变体进行截短，得到非血红素铁酶截短体BsQueD174pt，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.权利要求2所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体BsQueD174pt为亲本，发生突变得到的突变体：
4.根据权利要求3所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体BsQueD174pt-S116R突变体为亲本，发生突变得到的突变体：
5.根据权利要求4所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体BsQueD174pt-S116R-T118A突变体为亲本，发生突变得到的突变体：
6.根据权利要求5所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血
7.一种DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子编码权利要求1所述的非血红素铁酶突变体、权利要求2所述的非血红素铁酶截短体、或权利要求3-6任意一项所述的非血红素铁酶截短体突变体。
8.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求7所述的DNA分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求8所述的表达载体。
10.权利要求1所述的非血红素铁酶突变体、权利要求2所述的非血红素铁酶截短体、或权利要求3-6任意一项所述的非血红素铁酶截短体突变体、权利要求7所述的DNA分子、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞在合成手性伯胺化合物中的应用；所述的手性伯胺化合物如式Ⅰ和式Ⅱ所示：
11.一种手性伯胺化合物的合成方法，其特征在于：它是由式Ⅲ为底物，以权利要求1所述的非血红素铁酶突变体、权利要求2所述的非血红素铁酶截短体、或权利要求3-6任意一项所述的非血红素铁酶截短体突变体、权利要求7所述的DNA分子、权利要求8所述的表达载体、权利要求9所述的宿主细胞为生物催化剂，合成手性伯胺化合物；
...【技术特征摘要】
1.一种非血红素铁酶突变体，其特征在于：它是将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型非血红素铁酶bsqued，第234位，236位和275位的组氨酸突变为丙氨酸得到；其氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.一种非血红素铁酶截短体，其特征在于：它是对权利要求1所述的非血红素铁酶突变体进行截短，得到非血红素铁酶截短体bsqued174pt，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
3.权利要求2所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体bsqued174pt为亲本，发生突变得到的突变体：
4.根据权利要求3所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体bsqued174pt-s116r突变体为亲本，发生突变得到的突变体：
5.根据权利要求4所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体bsqued174pt-s116r-t118a突变体为亲本，发生突变得到的突变体：
6.根据权利要求5所述的非血红素铁酶截短体突变体，其特征在于：它是以非血红素铁酶截短体bsqued174pt-s116r...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾知军，李思怡，刘菲，陈鹏，王鑫，陈慧，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：
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