【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于crispr-cas9基因编辑系统在顶头孢霉中进行基因打靶的方法与应用，属于基因工程。
技术介绍
1、头孢菌素c是临床上广泛使用的头孢类抗生素的重要前体物，优点是具有较强的稳定性、广谱的抗性和较低的毒性等。顶头孢霉是一种重要的工业微生物，以其生产头孢菌素类抗生素而闻名。目前制药工业中头孢菌素c是由丝状真菌顶头孢霉(acremoniumchrysogenum)发酵生产的。目前顶头孢霉中头孢菌素c高产的合成调控机制没有得到解析，成为对菌种进行基因工程改造的瓶颈。不同于模式真菌构巢曲霉等研究较多的丝状真菌，顶头孢霉由于缺乏完善的遗传操作体系，应用基因定点敲入、基因替换、基因敲除和启动子替换等基因打靶的方法对顶头孢霉菌株进行现代分子遗传学研究还需进一步发展和优化。鉴于头孢类抗生素具有的市场前景，通过代谢工程等合成生物学技术对顶头孢霉菌株进行改造，解析头孢菌素c的合成调控机制，进一步提高头孢菌素c的发酵生产水平，降低生产成本，具有重要的意义和极大的发展潜力。
2、在丝状真菌中基因打靶引起dna的双链断裂，dna双...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas9技术适用于顶头孢霉工业菌株的基因编辑系统，其特征在于，所述系统在Cas9-sgRNA质粒上包括与启动子Pactin可操作连接的Cas9基因、与组成型5S核糖体RNA基因启动子P5S可操作连接的包括靶向序列的功能性sgRNA基因、与启动子PtrpC可操作连接的筛选标记基因，例如潮霉素磷酸转移酶基因hph，分别作为Cas9和筛选标记基因的终止子的TtrpC1和TtrpC2。
2. 一种基于CRISPR-Cas9技术适用于顶头孢霉工业菌株的基因编辑系统，其特征在于，所述系统在供体Donor DNA质粒是以质粒pUC19载体为骨架...
【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas9技术适用于顶头孢霉工业菌株的基因编辑系统，其特征在于，所述系统在cas9-sgrna质粒上包括与启动子pactin可操作连接的cas9基因、与组成型5s核糖体rna基因启动子p5s可操作连接的包括靶向序列的功能性sgrna基因、与启动子ptrpc可操作连接的筛选标记基因，例如潮霉素磷酸转移酶基因hph，分别作为cas9和筛选标记基因的终止子的ttrpc1和ttrpc2。
2. 一种基于crispr-cas9技术适用于顶头孢霉工业菌株的基因编辑系统，其特征在于，所述系统在供体donor dna质粒是以质粒puc19载体为骨架，包括基因打靶目的基因的上游基因序列500-1500 bp同源臂，筛选标记抗性基因表达盒，例如草铵膦抗性基因bar的表达盒和基因打靶目的基因的下游基因序列500-1500 bp同源臂。
3. 根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述筛选标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hph，所述启动cas9表达的启动子pactin的序列如seq id no.1所示；cas9的序列如seq id no.2所示；所述组成型5s核糖体rna基因启动子p5s的序列如seq id no.3所示；包括针对编辑的目标基因设计的靶向序列的sgrna序列，例如seq id no.4所示；所述启动子ptrpc的序列如seq id no.5所示；潮霉素磷酸转移酶hph基因的序列如seq id no.6所示；终止子ttrpc1的序列如seq id no.7所示；终止子ttrpc2的序列如seq id no.8所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的基因编辑系统，其特征在于，所述质粒骨架是丝状真菌中的随机整合质粒，例如是phyg，通过丝状真菌随机整合质粒将cas9核酸酶编码基因整合到顶头孢霉的基因组中。
5. 一种根据权利要求1-3所述的基因编辑系统构建同源重组效率高的重组顶头孢霉工程菌的方法，其特征在于，利用权利要求1和2构建的crispr-cas9基因编辑系统对顶头孢霉菌株的ku70基因进行敲除。首先构建靶向ku70基因序列的cas9-sgrna质粒和donor dna质粒；制备顶头孢霉原生质体，再将cas9-sgrna质粒和donor dna质...
【专利技术属性】
技术研发人员：高书山，丁忠涛，熊飞，刘向红，崔成森，巨晓芝，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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