一种长链寡核苷酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种长链寡核苷酸的制备方法，涉及长链寡核苷酸的合成技术领域。该方法在氨解后直接进行脱硅反应，无需进行除氨，在脱硅反应后直接淬灭反应，无需样品离心浓缩、干燥和乙醇沉淀等步骤，经纯化获得长链寡核苷酸。本发明专利技术采用固相合成的方法，整体上具有合成自动化程度高，合成周期短的技术优势，且长链寡核苷酸的制备工艺效率高，产出快。此外，设置疏水层析可耐受脱硅后粗品体系，减少了耗材的损耗，降低了核酸合成成本，有助于规模化合成长链寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及长链寡核苷酸的合成，具体而言，涉及一种长链寡核苷酸的制备方法。

技术介绍

1、以aso和sirna为代表的中短链寡核苷酸一般指25nt的寡核苷酸，是目前核酸药物的研究热门。而以sgrna为代表的长链寡核苷酸长度一般在100nt或以上，主要用于基因编辑crispr疗法，常用于罕见病的治疗。由于长链寡核苷酸的长度较长，目前除了一般的固相合成法外，还可以通过酶连法进行制备。

2、固相合成法的主要流程为在固相合成仪上首先进行载体上羟基的二对甲氧三苯甲基(dmt)的脱保护反应得到游离的羟基，随后将亚磷酰胺单体和活化剂催化下和被脱除dmt的羟基反应，形成一个新的亚磷酸三酯从而实现链的伸长。随后在氧化剂或硫化剂作用下将不稳定的三价磷氧化成五价磷，使用乙酸酐将未偶联成功的5’-oh进行盖帽，循环往复，最终得到目标序列的寡核苷酸。紧接着用浓氨水将寡核苷酸片段从固相树脂上切割下来，脱保护和纯化得到寡核苷酸。

3、酶连法的主要流程为先通过固相合成法制备较纯的短链寡核苷酸片段，再通过dna夹板、t4 rna连接酶的作用下进行片段连接后得到长链本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤S9中，所述疏水层析采用的层析柱为Phenyl-15L层析柱，规格为4.6mm×250mm，流动相A为高盐体系，其包括0-20mM磷酸盐、1.5-3M氯化钠和0-20％乙腈，pH为9.2±0.2，流动相B为低盐体系，其包括0-20mM磷酸盐和0-20％乙腈，pH为9.2±0.2。

3.根据权利要求2所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，纯化前将淬灭反应后的反应液使用流动相A稀释至电导＞120mS/cm，然后过滤后上样，流速为150cm/...

【技术特征摘要】

1.一种长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤s9中，所述疏水层析采用的层析柱为phenyl-15l层析柱，规格为4.6mm×250mm，流动相a为高盐体系，其包括0-20mm磷酸盐、1.5-3m氯化钠和0-20％乙腈，ph为9.2±0.2，流动相b为低盐体系，其包括0-20mm磷酸盐和0-20％乙腈，ph为9.2±0.2。

3.根据权利要求2所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，纯化前将淬灭反应后的反应液使用流动相a稀释至电导＞120ms/cm，然后过滤后上样，流速为150cm/h，监测260nm下的色谱峰；使用100％比例流动相a进行洗脱，至uv260nm＜50mau后，进行梯度洗脱，梯度洗脱的洗脱程序为0-100％，流动相b；

4.根据权利要求1所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤s7中，所述含氟试剂为三乙胺三氢氟酸盐；调节ph的试剂选自氨水或三乙胺；

5.根据权利要求1所述的长链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤s9之后，还包括dmt酸解：将80％乙酸溶液与s9疏水层析获得的洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵海，梁吉俊，
申请(专利权)人：苏州欧利生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：