【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因工程，尤其涉及转运蛋白在提高乳糖-n-新四糖产量和或纯度中的应用。
技术介绍
1、母乳中含多种活性生物分子，如低聚糖、免疫球蛋白、激素和生长因子等为幼儿的生长和发育提供了全面的重要营养素。母乳寡糖(hmos)是母乳中具有独特多样性结构的复杂低聚糖类的总称，具有丰富的生理功能。迄今为止，已鉴定出200多种不同种类的hmos，分中性岩藻糖基化、中性非岩藻糖基化和酸性唾液酸化糖三类。中性岩藻糖基化低聚糖中的乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose,lnnt)和乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose,lnt)是hmos的核心成分，在总母乳低聚糖中占比10％左右，也是现有研究的热点。
2、lnnt和lnt是由单体d-葡萄糖、d-半乳糖和n-乙酰氨基葡萄糖组成的寡同分异构体，同时也可作为衍生化的结构单元，通过将l-岩藻糖以不同糖苷键连接到lnnt和/或lnt中，形成一系列复杂的岩藻糖基化和/或唾液酸化的母乳低聚糖，约占总母乳低聚糖的20％。
3、在多种lnnt和lnt合成方法中，基于代谢工程的微生物合成是最有前途的方法。以微生物为宿主菌株，它可以利用乳糖生产高价值的化合物，展示了经济可行性、效率和环境可持续性的属性。合成lnnt和lnt均由两步反应合成，而乳糖-n-三糖ii(lacto-n-trioseii，lnt ii)是两者的共同前体，也是发酵过程中的主要副产物。当lnt ii以β-1,4键连接至受体底物上，可实现向lnnt的转化；以β-1,3键连接至受体底物上，则实现向l
4、此外，由于糖基转移酶的底物混杂，导致细长糖链结构的形成。研究者推测lnnt同样能够作为β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶的底物，形成中间五糖，经β-1,4-半乳糖基转移酶进一步转化为plnnh(乳糖-n-新六糖)。同样，plnnh可以作为下一个循环反应的底物，最终形成了plnno(乳糖-n-新八糖)，从而影响最终产品的质量。
5、早在2002年，研究者以大肠杆菌jm109为底盘细胞构建了lnnt的合成菌株，且伴有副产物lnt ii产生，并在发酵产物中发现了聚n-乙酰乳糖胺。随后的研究中，通过系统代谢工程开发了大肠杆菌bl21 star(de3)来合成lnnt。在进行了菌株筛选、高效的β-1,4-galt鉴定、关键基因表达调控和增强udp-半乳糖供应等改造后，产生22.07g/l lnnt和19.78g/llnt ii。lnt ii占比高除造成最终产品纯度低、增加分离纯化成本之外，还会造成底物乳糖的转化率低，原料成本的增加。有文献报道，过表达内源性大肠杆菌转运基因seta、setb、ydea和mdfa后lnt ii的产量显著增加，同时有研究者发现，敲除seta、setb、ydea和mdfa任一或任一以上基因后，均能提高lnnt产量，降低副产物lnt ii。但有研究认为，lnt ii从大肠杆菌输出到细胞外环境中，它就不能内化到细胞中并有效地转化为lnnt，提高lnt ii的转化率增强碳源利用，则对整个lnnt的生产过程至关重要。因此，转运蛋白的选择对lnnt生产过程中副产物含量的降低至关重要，亟需发现更多功能优异的转运蛋白以提高lnnt产物纯度和生产量。
技术实现思路
1、本专利技术参考以往研究，为了解决lnnt合成菌株副产物过高问题，综合考虑转运蛋白敲除和整合对菌株产物合成带来的影响，筛选了不同来源的lnnt转运蛋白进行整合，将胞内合成的lnnt进行转运至胞外，降低细胞压力的同时增强lnt ii利用率，及时外排lnnt减少长链结构产生，并提高lnnt产量，降低副产物，提高lnnt细胞稳定性。
2、一方面，本申请提供了转运蛋白在提高乳糖-n-新四糖产量和/或纯度中的应用，所述转运蛋白至少包括下述a1)-a8)任一种及以上：
3、a1)serratia fonticola来源的转运蛋白；优选的，所述serratia fonticola来源的转运蛋白为sfset；更优选的，所述sfset包含如seq id no.10所示氨基酸序列或与seqid no.10具有98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列；
4、a2)escherichia fergusonii来源的转运蛋白；优选的，所述escherichiafergusonii来源的转运蛋白为emfst；更优选的，所述emfst包含如seq id no.12所示氨基酸序列或与seq id no.12具有98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列；
5、a3)chimaeribacter californicus来源的转运蛋白；优选的，所述chimaeribacter californicus来源的转运蛋白为camfst；更优选的，所述camfst包含如seq id no.14所示氨基酸序列或与seq id no.14具有98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列；
6、a4)unclassified serratia(mfs transporter)来源的转运蛋白；优选的，所述unclassified serratia(mfs transporter)来源的转运蛋白为usset；更优选的，所述usset包含如seq id no.16所示氨基酸序列或与seq id no.16具有98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列；
7、a5)gibbsiella quercinecans来源的转运蛋白；优选的，所述gibbsiellaquercinecans来源的转运蛋白为gqset；更优选的，所述gqset包含如seq id no.18所示氨基酸序列或与seq id no.18具有98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％同一性的氨基酸序列；
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1.转运蛋白在提高乳糖-N-新四糖产量和/或纯度中的应用，其特征在于，所述转运蛋白至少包括下述A1)-A8)任一种及以上：
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述B1)-B3)中至少一种：
3.根据权例要求2所述的生物材料，其特征在于，B1)所述的核酸分子包括C1)-C9)中的任一种及以上：
4.可分泌表达乳糖-N-新四糖的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包括下述D1)-D4)任一种及以上：
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包含下述E1)-E2)任一种：
6.一种用于制备乳糖-N-新四糖的全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂包括权利要求4或5所述重组微生物。
7.一种生产乳糖-N-新四糖的方法，其特征在于，所述方法包括利用如权利要求4或5所述的重组微生物或如权利要求6所述的全细胞催化剂发酵生产乳糖-N-新四糖。
8.如权利要求2或3所述的生物材料、如权利要求4或5所述的重组微生物、如权利要求6所述的全细胞催化剂或如权利要求7所述的方法在提高乳糖-N
9.如权利要求2或3所述的生物材料、如权利要求4或5所述的重组微生物、如权利要求6所述的全细胞催化剂或如权利要求7所述的方法在降低乳糖-N-新四糖产品中副产物的应用。
10.如权利要求2或3所述的生物材料、如权利要求4或5所述的重组微生物、如权利要求6所述的全细胞催化剂或如权利要求7所述的方法在降低乳糖-N-新四糖产品中乳糖-N-三糖和/或乳糖-N-新六糖的应用。
...【技术特征摘要】
1.转运蛋白在提高乳糖-n-新四糖产量和/或纯度中的应用，其特征在于，所述转运蛋白至少包括下述a1)-a8)任一种及以上：
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述b1)-b3)中至少一种：
3.根据权例要求2所述的生物材料，其特征在于，b1)所述的核酸分子包括c1)-c9)中的任一种及以上：
4.可分泌表达乳糖-n-新四糖的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包括下述d1)-d4)任一种及以上：
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包含下述e1)-e2)任一种：
6.一种用于制备乳糖-n-新四糖的全细胞催化剂，其特征在于，所述全细胞催化剂包括权利要求4或5所述重组微生物。
7.一种生产乳糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，赵春华，朱莺莺，刘丹，贾玉香，王瑞妍，
申请(专利权)人：北京华熙荣熙生物技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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