抗原组合物制造技术

本发明专利技术涉及抗原组合物及使用该抗原组合物使动物免疫的方法。该抗原组合物包含通常情况下为固体形式的脂质制剂及至少一种抗原成分。优选的抗原成分为活的有机体。在优选的实施方案中该组合物被配制成口服使用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及脂质用于制备抗原组合物的用途，特别是制备活的细菌疫苗的用途，及使用该组合物使动物免疫的方法。
技术介绍
大多数人和动物的病原体，包括那些引起肺结核(TB)的病原体，可通过粘膜表面引发感染。因此，对抗这些病原体的保护性免疫可能需要强粘膜免疫反应的诱导。然而，在非肠道免疫后的粘膜免疫反应一般较弱。尽管对保护粘膜位点的疫苗，特别是TB疫苗有着明显的需要，但当前使用的疫苗是通过皮内或皮下注射使用的。因而人们希望开发更有效的组合物，和/或可选择途径的疫苗给药系统。特别是口服疫苗具有许多优点，包括易于服用，并以粘膜免疫反应为目标。尽管如此，能够对动物和人提供粘膜和/或系统免疫的口服疫苗到目前为止大多是无效的。这种疫苗的功效受到在其通过肠道时疫苗退化的影响。特别是大多数抗原化合物具有肽键，其很容易被肠道中的胃酶和蛋白酶分解。许多疫苗依赖于有机体冻干制剂的使用。例如，目前使用的人TB疫苗以被称为卡介苗(BCG)的活减毒细菌的冻干制剂为基础。然而，已表明冻干过程可导致BCG活性损失30-50％并损害剩余活细菌的恢复(7)。可在使用前使有机体保持较大活性的组合物将极大地提高疫苗的功效。为改善免疫反应，抗原与许多佐剂混合以刺激免疫原性。这些佐剂主要是明矾和水包油型乳化液。后一类以弗氏(Freund’s)矿物油佐剂为代表。然而，在人和脊椎动物疫苗中使用弗氏完全佐剂(FCA)是不可取的，因为已有毒性反应的报道。基于这些理由，弗氏佐剂可能也不适用于口服。在其它的水包油型乳化液中因为油含量高，所以需要表面活性剂。表面活性剂的清洁性使它们不适用于肠道或口服使用。另外，甚至对于被批准使用的表面活性剂也有毒性反应的报道。乳化液其它的缺点在于其是一种液体分散于另一种液体中时不能混溶的异质系统，该系统是不稳定的，并且水相随时间发生分离，这对使疫苗保持在稳定的悬浮液中造成困难。此外，防止在油包水型乳化液的水相中截留的抗原免于降解是不可能的。也研究了脂质体和脂质囊泡在疫苗上的使用，特别是对容易胶囊化的较小抗原成分而言。通常，脂质体和脂质囊泡对于较大抗原如活的微生物的胶囊化是无效的。另外，脂质体和脂质囊泡生产成本高且生产耗时，并且在它们的制备中所用的提取过程可能导致疫苗制剂化学结构或活性改变，因此导致疫苗免疫原性的改变。例如，受热和溶剂可能改变抗原成分如蛋白质的生物学完整性。因此本专利技术的目的是提供一种抗原组合物和/或给药系统，其可解决这些需要或至少为公众提供一种有用的选择。专利技术概述因此，在第一个方面本专利技术提供一种抗原组合物，其包含脂质制剂和至少一种抗原成分，该抗原成分包含活的有机体。优选地，该脂质制剂是固体形式。在另一个方面本专利技术提供一种抗原组合物，其包含在10℃或以上时为固体形式的脂质制剂和至少一种抗原成分。优选地，在本专利技术的组合物中使用的脂质制剂包含长链脂肪酸。在脂肪酸组分方面，优选的脂质制剂包含40％-100％，优选为60％-100％，更优选为80％-100％，再更优选为90％-100％的C16和/或C18脂肪酸。更优选的组合物含有脂质制剂，该脂质制剂包含少于35％，优选少于25％，更优选少于10％的C14或更短的脂肪酸。在一种实施方案中，脂质制剂包含20％-60％的饱和脂肪酸；25％-60％的单不饱和脂肪酸；及0.5％-15％的多不饱和脂肪酸。在特别优选的组合物中，脂质制剂包含35％-50％的饱和脂肪酸；40％-55％的单不饱和脂肪酸；及5％-9％的多不饱和脂肪酸。在本专利技术中所用的通常优选的脂质制剂具有以下配方3％的肉豆蔻酸；26％的棕榈酸；15％的硬脂酸；40％的油酸；及6％的亚油酸。抗原成分可以是蛋白质、糖蛋白质、肽、或者具有蛋白质或肽成分的因子。在一种实施方案中，抗原成分包含活的有机体。优选地，本专利技术组合物中的活的有机体是细菌，特别是非病原性细菌，更优选属于分支杆菌属的细菌。本专利技术中使用的特别优选的分支杆菌是牛型结核菌(Mycobacterium bovis)BCG。在一种实施方案中，组合物包含至少两种抗原成分。第一种优选为活的有机体，而第二种抗原成分优选取自传染媒介或者是弱免疫原性的蛋白质或肽。在另一个方面，本专利技术提供一种制备本专利技术的抗原组合物的方法，该方法包括将抗原成分与脂质制剂混合。在另一个方面，本专利技术还提供一种使动物免疫的方法，该方法包括对所述的动物使用本专利技术的抗原组合物。在另一个方面，本专利技术提供一种刺激动物中粘膜免疫反应的方法，该方法包括对所述的动物使用本专利技术的抗原组合物。在这些方法中该组合物的使用优选通过口服途径。本专利技术还涉及脂质制剂在制备本专利技术的抗原组合物中的用途。附图简要说明现在将参照附图对本专利技术的各方面进行描述，其中附图说明图1，脂质制剂的脂肪酸组分。按照标准方案用气相色谱分析脂质。各脂质的脂肪酸组分以总脂肪酸组分的百分比表示。图2，配制且储存在4℃(2a)或室温(10-25℃)(2b)的脂质中后BCG的活性。BCG制剂被加温到37℃并在7H9肉汤中乳化。通过将连续10倍稀释的各乳化液接种到7H11琼脂平板上确定活的有机体的数目。在培养2-3周后确定制剂介质的CFU/ul数目。结果表示的是两次试验的结果且用平均数表示。图3，在口服不同剂量的按配方配制的M.bovis BCG疫苗后的牛PPD诱导的IFN-γ反应。小鼠在口服按配方配制的M.bovis BCG(圆形)、非按配方配制的M.bovis BCG(三角形)或仅用制剂材料(菱形)后第8周处死。脾细胞用牛PPD孵育72小时，然后收集上清液并用夹心ELISA法进行分析。每个处理组包含6只小鼠，脾被单独地处理。结果以pg/ml表示，并用三次测定的平均值表示。竖条表示标准误差。图4，在BALB/c小鼠中对M.bovis BCG疫苗抗原诱导的脾IFN-γ反应。在皮下注射106CFU的M.bovis BCG疫苗(方形)、口服107CFU的按配方配制的M.bovis BCG疫苗(圆形)、非按配方配制的M.bovis BCG(三角形)或仅用制剂材料(菱形)后的第2、4、6和8周无痛处死小鼠。脾细胞用牛PPD孵育72小时，然后收集上清液并用夹心ELISA法进行分析。每个处理组包含5-6只小鼠，脾被单独地处理。第8周的结果来自2个分离的试验，P值＜0.05(Student t检验)。竖条表示标准误差。图5，与非粘附腹膜浆细胞(NPEC)共培养的巨噬细胞对M.bovis的生长抑制。用M.bovis以每个巨噬细胞两个细菌的MOI感染巨噬细胞，非粘附的自体同源NPEC按每个巨噬细胞10NPEC的比率加入。在感染后72小时对尿嘧啶混合进行分析。不含M.bovis的细胞培养的平均尿嘧啶摄入是460cpm。共培养巨噬细胞和NPEC的细胞内细菌的生长用三次的平均值表示。结果代表两个试验。*表示与仅含制剂材料的对照组的平均值有显著差异的平均值；竖条表示标准误差。图6，负鼠口服接种按配方配制的BCG对体外外周血淋巴细胞对PPD-B的母细胞化反应(blastogenic response)的影响。按配方配制的BCG◆---◆；非按配方配制的BCG■---■；非接种的对照X---X；结果以平均刺激指数(SI)表示。*表示与非接种的对照组的平均值有显著差异的平均值。竖条表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原组合物，其包含脂质制剂和至少一种抗原成分，所述抗原成分包含活的有机体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克欧内斯特阿尔德威尔，布赖斯马尔科姆巴都，伊恩乔治塔克，
申请(专利权)人：奥塔戈创新公司，动物健康委员会公司，阿戈里索契有限公司，
类型：发明
国别省市：NZ[新西兰]