【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器及其应用。
技术介绍
1、电化学生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、材料、电子技术等多种学科相互渗透成长起来的高新技术，它是将生物分子的特异性识别与高灵敏的传感技术相结合而发展起来的一类新型检测技术，具有快速、灵敏、操作简便等特点，已广泛应用于临床检验的各个方面。与传统的检测技术相比,电化学生物传感技术具有以下优点：(1)灵敏度高，精度高，可实现生物靶分子的定量分析；(2)特异性高,生物分子识别元件能够选择性地与生物靶分子结合；(3)检测时间短,完成单次检测时间约为15 ~ 60 分钟；(4)实时检测，能实时动态监测生物分子反应的整个过程。纳米粒子具有很强的抗氧化性能，基本无毒，生物相容性好，导电性能强，广泛应用于电化学生物传感器，通过具有良好性能的纳米粒子进行信号放大，对提高检测方法的灵敏度至关重要。采用纳米粒子和多层多孔膜构建电化学生物传感器，可以大大提高分析方法的灵敏度以及生物传感器的性能，从而实现对目标物质的高性能检测。但传统的纳米粒子修饰电化学生物传感器存在两个主要的缺陷：第一，传统的纳米粒子修饰电化学生物传感器需要把纳米粒子修饰在电极表面，电极的修饰通常需要逐个进行，因此极大的加大了制备成本，限制了他们应用于大规模生产电化学生物传感器，第二，传统的纳米粒子修饰电化学生物传感器制备步骤复杂，不具备同时检测多个目标物或分别检测不同目标物，且特异性低。
2、因此，开发一种能够制备简单、成本低、高灵敏、特异性高、多靶
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器及其应用，具备高灵敏、高特异性、快速检测和可以同时检测多种目标物的优点。
2、本专利技术的技术方案具体如下：一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，以重离子轰击的聚合物膜为基材，先用紫外光照射使其敏化，其次对其进行化学刻蚀制备不同形状纳米孔道，制备含有多个纳米孔道的薄膜；在多孔膜的纳米孔道内修饰纳米粒子，再将其通过自组装在孔道表面修饰上聚乙烯亚胺，然后在纳米孔道表面修饰捕获探针，制备成纳米粒子修饰捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜，用牛血清白蛋白对纳米孔道进行活性位点封闭；最后将多个不同捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，从而得到一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
3、所述技术方案的多层多孔膜为聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5 µm，纳米孔道的形状为柱状、锥状、不规则状，孔密度为1×103~1×1015/cm2。
4、所述技术方案的紫外光波长为300~400 nm，刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6mol/l~9 mol/l，纳米粒子为金纳米粒子，直径为10~20 nm。
5、所述技术方案的经过蚀刻的纳米孔道表面因含有羧基而带有负电荷，与带有正电荷的pei通过静电相互作用结合，此时纳米孔道呈正电荷，然后与带有负电荷的捕获探针dna再次通过静电作用结合，进而得到捕获探针dna功能化的纳米孔道。
6、按上述方案，所述目标物可以为核酸、蛋白。
7、所述技术方案的捕获探针为能够与目标物发生特异性结合的生物序列，可以识别和捕获目标物；目标物与捕获探针dna发生结合产生电流响应，达到对目标物的超灵敏检测。
8、一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其通过电化学方法，以纳米粒子修饰的多层捕获探针dna纳米孔道膜作为检测材料，基于dna杂交反应，对目标物进行检测，其中纳米粒子修饰的多层捕获探针dna纳米孔道膜按如下步骤进行制备：（1）先用加速器加速的重离子轰击聚合物膜，然后用紫外灯对其进行照射2小时，使其敏化；（2）用适当的化学刻蚀液进行刻蚀，把薄膜上的径迹蚀刻成不同形状的纳米孔道，即制得多孔膜；（3）将多孔膜在含有纳米粒子水溶液中浸泡10分钟，然后取出修饰有纳米粒子的多孔膜，用水冲洗，在空气中晾干，制成纳米粒子修饰的多孔膜；（4）将纳米粒子修饰的多孔膜在聚乙烯亚胺（pei）水溶液中浸泡12小时，将其自组装到修饰纳米粒子的多层多孔膜，用去离子水洗涤膜，在空气中晾干；（5）将纳米粒子修饰的多孔膜浸入捕获探针dna溶液中，在室温下孵育2小时，孵育后，用去离子水洗涤以去除未结合的捕获探针dna，得到纳米粒子修饰捕获探针dna功能化纳米孔道复合膜；（6）将纳米粒子修饰捕获探针dna功能化纳米孔道复合膜浸入牛血清蛋白（bsa）水溶液，孵育2小时，用去离子水清洗，在空气中晾干，最后将多个不同捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，即制成了纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
9、其中，所述聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜、聚碳酸酯（pc）膜或聚酰亚胺（pi）膜，紫外光灯波长为300~400 nm。
10、其中，所述化学刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6 mol/l~9 mol/l，纳米孔道的形状为柱状、锥状、不规则状。
11、其中，所述纳米粒子为直径10~20 nm的金纳米粒子。
12、其中，pei水溶液浓度为1 mg/ml~3 mg/ml，ph 7.0~8.0；孵育条件为室温下孵育。
13、其中，捕获探针dna水溶液浓度为2 µmol/l~5 µmol/l，ph 7.0~8.0；bsa水溶液浓度为8 mg/ml~10 mg/ml，ph 7.0~8.0。
14、其中，bsa水溶液浓度为8 mg/ml~10 mg/ml，ph 7.0~8.0。
15、此外，本专利技术还提供了一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的应用，主要步骤如下：将纳米粒子修饰的多层多孔膜置于h型电解池中间，在h型电解池中加入相同浓度的电解质溶液，将一对ag/agcl电极放在两个半电解池中，连接外部负载构成回路，连接外部负载构成回路，进行测试i-v电流，获得孵育前的电流值i0；然后将电解池中电解质溶液吸出，用去离子水清洗复合膜，将目标物标准样品和杂交缓冲液混合均匀后加入电解池中，在室温下孵育1小时，孵育后，吸出孵育液，用去离子水洗去复合膜表面的残留的目标物，加入电解质溶液，测试目标物标准样品的i-v电流，得到孵育后目标物标准品的电流值i，然后依次重复进行多次得到孵育前后不同浓度目标物标准样品的电流值i0和i，最后计算相同条件下不同浓度目标物标准样品孵育前后的电流变化率(i-i0)/i0，以目标物浓度对数为横坐标，电流变化率为纵坐标绘制标准曲线；然后按照上述步骤进行测试得到待测样品孵育前后的电流值i0和i，根据标准曲线计算待测样品中目标物的浓度。
16、其中，电解质溶液为0.1 mol/l~0.5 mol/l的氯化钾溶液，杂交缓冲液为tris缓冲液，浓度为0.1 µmol/l~0.5 µmol/l，目标物的浓度为0.5 µmol/l~2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，以重离子轰击的聚合物膜为基材，用紫外光照射使其敏化，再对其进行化学刻蚀制备不同形状纳米孔道，制备含有多个纳米孔道的薄膜；在多孔膜的纳米孔道内修饰纳米粒子，再将其通过自组装在孔道表面修饰上聚乙烯亚胺，然后在纳米孔道表面修饰捕获探针，制备成纳米粒子修饰捕获探针DNA功能化的纳米孔道复合膜，用牛血清白蛋白对纳米孔道进行活性位点封闭；最后将多个不同捕获探针DNA功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，从而得到一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，经过化学刻蚀形成纳米孔道孔道表面含有负电荷的羧基，将带正电荷的聚乙烯亚胺通过静电作用自组装在纳米孔道表面；然后将带负电荷的捕获探针DNA进一步组装在带正电荷孔道中，用带有负电荷的牛血清白蛋白对含有纳米粒子修饰捕获探针DNA功能化的纳米孔道进行活性位点封闭；最后将多个不同捕获探针DNA功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，从而得到一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。p>
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，所述聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜、聚碳酸酯（PC）膜或聚酰亚胺（PI）膜，纳米孔道的形状为柱状、锥状、不规则状，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5µm，孔密度为1×103~1×1015个/cm2。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述电化学生物传感器具体步骤如下：（1）先用加速器加速的重离子轰击聚合物膜，然后用紫外灯对其进行照射2小时，使其敏化；（2）用适当的化学刻蚀液进行刻蚀，把薄膜上的径迹蚀刻成不同形状的纳米孔道，即制得多孔膜；（3）将多孔膜在含有纳米粒子水溶液中浸泡10分钟，然后取出修饰有纳米粒子的多孔膜，用水冲洗，在空气中晾干，制成纳米粒子修饰的多孔膜；（4）将纳米粒子修饰的多孔膜在聚乙烯亚胺（PEI）水溶液中浸泡12小时，将其自组装到修饰纳米粒子的多层多孔膜，用去离子水洗涤膜，在空气中晾干；（5）将纳米粒子修饰的多孔膜浸入捕获探针DNA溶液中，在室温下孵育2小时，孵育后，用去离子水洗涤以去除未结合的捕获探针DNA，得到纳米粒子修饰捕获探针DNA功能化纳米孔道复合膜；（6）将纳米粒子修饰捕获探针DNA功能化纳米孔道复合膜浸入牛血清蛋白（BSA）水溶液，孵育2小时，用去离子水清洗，在空气中晾干，最后将多个不同捕获探针DNA功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，即制成了纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
5.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜、聚碳酸酯（PC）膜或聚酰亚胺（PI）膜，紫外光灯波长为300~400 nm。
6.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中化学刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6 mol/L~9 mol/L，纳米孔道的形状为柱状、锥状、不规则状。
7.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中纳米粒子为直径10~20 nm的金纳米粒子。
8.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中PEI水溶液浓度为1 mg/mL~3 mg/mL，pH 7.0~8.0；孵育条件为室温下孵育。
9.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中捕获探针DNA水溶液浓度为2 µmol/L~5 µmol/L，pH7.0~8.0；BSA水溶液浓度为8 mg/mL~10 mg/mL，pH 7.0~8.0。
10.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中BSA水溶液浓度为8 mg/mL~10 mg/mL，pH 7.0~8.0。
11.一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的应用，其特征在于，具体检测过程如下：将权利要求1中所示电化学生物传感器置于H型电解池中间，在H型电解池中加入相同浓度的电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极放在两个半电解池中，连接外部负载构成回路，进行测试I-V电流，获得孵育前的电流值I0；然后将电解池中...
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，以重离子轰击的聚合物膜为基材，用紫外光照射使其敏化，再对其进行化学刻蚀制备不同形状纳米孔道，制备含有多个纳米孔道的薄膜；在多孔膜的纳米孔道内修饰纳米粒子，再将其通过自组装在孔道表面修饰上聚乙烯亚胺，然后在纳米孔道表面修饰捕获探针，制备成纳米粒子修饰捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜，用牛血清白蛋白对纳米孔道进行活性位点封闭；最后将多个不同捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，从而得到一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，经过化学刻蚀形成纳米孔道孔道表面含有负电荷的羧基，将带正电荷的聚乙烯亚胺通过静电作用自组装在纳米孔道表面；然后将带负电荷的捕获探针dna进一步组装在带正电荷孔道中，用带有负电荷的牛血清白蛋白对含有纳米粒子修饰捕获探针dna功能化的纳米孔道进行活性位点封闭；最后将多个不同捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，从而得到一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器，其特征在于，所述聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜、聚碳酸酯（pc）膜或聚酰亚胺（pi）膜，纳米孔道的形状为柱状、锥状、不规则状，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5µm，孔密度为1×103~1×1015个/cm2。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述电化学生物传感器具体步骤如下：（1）先用加速器加速的重离子轰击聚合物膜，然后用紫外灯对其进行照射2小时，使其敏化；（2）用适当的化学刻蚀液进行刻蚀，把薄膜上的径迹蚀刻成不同形状的纳米孔道，即制得多孔膜；（3）将多孔膜在含有纳米粒子水溶液中浸泡10分钟，然后取出修饰有纳米粒子的多孔膜，用水冲洗，在空气中晾干，制成纳米粒子修饰的多孔膜；（4）将纳米粒子修饰的多孔膜在聚乙烯亚胺（pei）水溶液中浸泡12小时，将其自组装到修饰纳米粒子的多层多孔膜，用去离子水洗涤膜，在空气中晾干；（5）将纳米粒子修饰的多孔膜浸入捕获探针dna溶液中，在室温下孵育2小时，孵育后，用去离子水洗涤以去除未结合的捕获探针dna，得到纳米粒子修饰捕获探针dna功能化纳米孔道复合膜；（6）将纳米粒子修饰捕获探针dna功能化纳米孔道复合膜浸入牛血清蛋白（bsa）水溶液，孵育2小时，用去离子水清洗，在空气中晾干，最后将多个不同捕获探针dna功能化的纳米孔道复合膜组装在一起，即制成了纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器。
5.根据权利要求4所述的一种基于纳米粒子修饰多层多孔膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（...
【专利技术属性】
技术研发人员：阎尔坤，师钰博，赵卫军，白红升，
申请(专利权)人：天津市协和医药科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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