【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法。
技术介绍
1、随着基因编辑技术的飞速发展，提高基因编辑效率成为了各大行业的研究重点。crispr/cas9技术自2013年以来受到科研工作者的高度重视，成为基因敲除和基因敲入的主要研究手段。然而，在进行大片段敲入时，传统的双链dna(dsdna)供体存在随机插入和敲入效率低的问题，限制了其在精准基因编辑中的应用。相比之下，长单链dna(long ssdna)因其敲入效率高、能有效避免dsdna片段在基因组中随机插入的问题等优势脱颖而出。研究表明，使用long ssdna作为“donor template”时，片段敲入效率可达到8.5-100％，极大缩短了建模周期。但现有技术中ssdna的纯化方式多通过割胶回收方式进行纯化，此方式对下游递送受精卵环节造成的毒性过大，导致效果大大降低。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法。本专利技术通过如下技术方案实现上述目的：一种低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法，将目的片段进行扩增，通过无缝连接将目的片段构建到骨架中；
2、pcr鉴定获取到阳性克隆后进行sanger测序鉴定，无误后选取其作为阳性模板；
3、对目的区域进行pcr扩增，扩增产物使用清洁试剂盒进行产物清洁；
4、使用lamda核酸外切酶对产物进行一定时间一定温度的消化，消化后产物进行电泳跑胶；
5、
6、将纯化后的液体吸入离心管中，放入冷冻干燥机冻干待用。
7、进一步的，所述骨架为prb322骨架。
8、进一步的，所述消化温度37℃左右，消化时间30min左右。
9、进一步的，纯化时间为大约16小时。
10、进一步的，使用5端磷酸化引物对目的区域进行pcr扩增。
11、与现有技术相比，本专利技术低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法的有益效果是：在注射的卵存活率和基因编辑效率上有较大突破，最高阳性率达到52％。相较于传统制备和纯化方法，该方法对卵损伤更低，样品纯度更高。
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1.一种低毒低敏高纯度注射用ssDNA制备和纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssDNA制备和纯化方法，其特征在于：所述骨架为pRB322骨架。
3.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssDNA制备和纯化方法，其特征在于：所述消化温度37℃左右，消化时间30min左右。
4.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssDNA制备和纯化方法，其特征在于：纯化时间大约为16小时。
5.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssDNA制备和纯化方法，其特征在于：使用5端磷酸化引物对目的区域进行PCR扩增。
【技术特征摘要】
1.一种低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法，其特征在于：所述骨架为prb322骨架。
3.根据权利要求1所述的低毒低敏高纯度注射用ssdna制备和纯化方法，其特征在于：所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨明，竺勤章，
申请(专利权)人：昆山鸣谦微生物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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