【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种单颗脂滴水平与单细胞水平解析的脂滴降解检测、定量分析方法及其应用。
技术介绍
1、人体脂肪大多储存在脂肪组织中，其中脂肪细胞是主要负责储存脂质作为备用能量储存的重要细胞类型，并且储存的脂质以甘油三酯为主储存在细胞中的脂滴。当人体在饥饿或运动时需要补充能量时，脂肪细胞接收到去甲肾上腺素或异丙肾上腺素等信号而激活细胞内脂滴中的甘油三酯降解为游离脂肪酸，这样的过程称之为脂滴降解，这是个动态的生物学功能现象。当游离脂肪酸进一步在线粒体中被β氧化降解后，可以产生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，atp）能量供细胞活动使用，所以检测细胞的脂解能力是表征细胞内的脂质降解代谢与能量产生的关键指标。当细胞的脂质降解代谢能力下降会导致脂质储存在细胞中异常积累增加，进而导致肥胖或脂肪肝等疾病的发生，所以测量细胞的脂解能力是评估肥胖等代谢性疾病发生风险的重要检测技术需求。
2、目前用于检测细胞内的甘油三酯降解的常用方法主要有甘油释放的生化测定法与脂肪酸的同位素标记测定方法，这两种方法的检测原理都是基于甘油三酯的降解反应，通过测定脂解产生的甘油或游离脂肪酸释放到细胞培养基的含量来量化细胞的脂解能力。但这两种脂解测定方法有三大技术缺点：（1）所需的细胞量较大，并且需要使用生化试剂盒或同位素标记底物，具有一定的测量成本，特别是对于细胞样本数过大的脂解测定并不适用。（2）由于使用大量细胞，即是在群体细胞水平下进行脂解测定，所以测量结果是一群细胞的平均脂解水平，并不适用于单细胞检测分析。（3）脂
3、为了解决上述技术当前缺乏对脂解测量的可视性以及直观性等关键技术问题，通过细胞器动态成像技术建立新型脂滴降解检测和定量分析装置与方法来获得脂滴降解特性是必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于活细胞成像技术与生物物理建模分析，建立单颗脂滴水平与单细胞水平解析的脂滴降解的检测装置和定量分析方法。本专利技术在激活细胞脂解信号的情况下，使用高质量的活细胞成像与图像分析获得细胞内脂滴的大小与数量的动态变化，再通过生物物理建模分析手段获得细胞内每一颗可见脂滴的降解速率等特性的定量数据，实现单颗脂滴降解速率以及脂解酶活性效率的定量分析，以及单细胞水平解析的脂解定量分析。本专利技术简单、准确、可视性以及直观性高，具有广阔的应用前景。
2、为了实现上述目的，本专利技术第一个方面公开了一种单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
3、s1、对用于检测的细胞进行处理；
4、s2、对s1处理后的细胞进行高倍率拍摄成像，得到脂滴变化的图像数据；
5、s3、对s2得到的图像数据进行图像处理与分析。
6、优选地，s3的处理与分析步骤如下：
7、a1、以脂滴为球体的设定进行图像处理与分析，在一组时间序列采集的活细胞动态明场图像数据集中量测单一细胞内每颗可见脂滴的直径为d并记录成随时间变化的脂滴直径曲线，经过球形体积的计算为 ，每颗可见脂滴体积可以记录成随时间变化的脂滴体积曲线图，并在单位时间内 ，将单颗脂滴体积缩小的变化量定义为脂解速率为；可用于量化表征脂肪细胞中单一颗脂滴降解的快慢；
8、a2、计算a1中获得的随时间变化的脂滴降解速率与脂滴表面积大小之间的关系，并作图记录该脂滴降解速率随脂滴表面积变化的曲线图，可以发现当每颗脂滴降解缩小过程中，脂滴降解速率随脂滴表面积缩小呈现线性减小变化，获得到线性变化率为，定义为脂解酶活性效率。
9、利用上述方法可以对脂肪细胞中脂滴降解速率实现定量检测。
10、优选地，s1中细胞的培养方法为：将细胞培养细胞密度达到120%充分接触抑制后，加入诱导培养基，诱导培养2天后换为成熟培养基，第4天换成新鲜的成熟培养基，继续培养2天。分化到第6天换成分化培养基继续培养，直到第8天诱导分化成3t3-l1脂肪细胞。细胞全程培养在37℃、5%二氧化碳培养箱中。
11、（诱导培养基中含有高糖dmem培养基、10% 胎牛血清、1% 青/链霉素、5 µg/ml 胰岛素、0.5 mm竞争性磷酸二酯酶抑制剂ibmx、1 µm地塞米松和1 µm罗格列酮）
12、（成熟培养基中含有高糖dmem培养基、10% 胎牛血清、1%青/链霉素和5 µg/ml胰岛素）
13、（分化培养基高糖dmem培养基中含有高糖dmem培养基、10% 胎牛血清和1% 青/链霉素）。
14、通过以上试剂处理后所获得的脂肪细胞拥有储存较大、较多的脂滴，有助于后续脂滴的高倍率成像，以及获得更加显著变化的脂滴动态图像数据。
15、s1中利用10 µm异丙肾上腺素处理s1得到的细胞，
16、优选地，s2的具体步骤为：明场显微镜下使用100倍物镜放大倍率对细胞观察，以10分钟为时间间格、总时长设定为7小时拍摄记录1080*1080像素的活细胞动态明场图像，储存记录脂解过程中观察视野内所有细胞的脂滴动态变化。
17、动态成像技术和高清图像储存技术的不断提升实现了高质量的活细胞成像与图像分析，使得研究人员可以实时观察细胞生物学功能发生期间其内部细胞器结构的动态变化过程，并进一步实现高质量的结构变化与定位的动态定量分析，这对于通过直观的观察与测量来解释如脂质储存相关的脂滴降解等生物学的调控机制是至关重要。其次，得益于显微镜自动化成像和计算机大数据分析等技术的迅猛发展，目前已可以实现高分辨率、高通量、高度自动化、多参数分析等细胞器成像与影像定量分析的特点。
18、本专利技术第二个方面公开了上述方法在测量细胞脂肪降解能力中的应用。所述应用还包括对肥胖代谢性疾病发生风险的评估。
19、相对于现有技术，本专利技术取得如下有益效果：本专利技术属于脂质分解代谢定量检测和细胞图像分析处理的学科交叉应用领域，具体涉及通过活细胞图像定量分析手段对脂肪细胞中脂滴降解速率实现定量检测。本专利技术结合显微镜成像与生物物理建模方法，特别适用于在微量细胞数量（细胞数小于100个）的情况下检测脂解酶的活性程度与脂滴降解速率大小，并且也适用于原代成熟脂肪细胞的脂解检测。本专利技术基于一般的显微镜明场成像，简单不需要现有脂解测量技术所需的化学试剂或同位素标记，展现准确、定量、重复性高的检测优势，可以客观准确地提供单颗脂滴水平与单细胞水平解析的脂解速率的定量分析测量，具有广阔的应用前景。
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1.一种单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，S1中所述细胞包括正常诱导分化得到的成熟细胞、或由如下方法培养得到：
3.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，所述诱导培养基中含有高糖DMEM培养基、10% 胎牛血清、1% 青/链霉素、5 µg/mL 胰岛素、0.5 mM竞争性磷酸二酯酶抑制剂IBMX、1 µM地塞米松和1 µM罗格列酮。
4.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，所述成熟培养基中含有高糖DMEM培养基、10% 胎牛血清、1%青/链霉素和5 µg/mL胰岛素。
5.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，所述分化培养基高糖DMEM培养基中含有高糖DMEM培养基、10% 胎牛血清和1% 青/链霉素。
6.根据权利要求1
7.根据权利要求1所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，S2中高倍率拍摄成像的具体步骤为：在明场显微镜下使用高倍物镜放大倍率对细胞观察，以10分钟为时间间格、总时长设定为7小时拍摄记录1080*1080像素的活细胞动态明场图像，储存记录脂解过程中观察视野内所有细胞的脂滴动态变化。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法在测定细胞脂肪降解能力中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用还包括对肥胖代谢性疾病发生风险的评估。
...【技术特征摘要】
1.一种单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，s1中所述细胞包括正常诱导分化得到的成熟细胞、或由如下方法培养得到：
3.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，所述诱导培养基中含有高糖dmem培养基、10% 胎牛血清、1% 青/链霉素、5 µg/ml 胰岛素、0.5 mm竞争性磷酸二酯酶抑制剂ibmx、1 µm地塞米松和1 µm罗格列酮。
4.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的脂滴降解检测和定量分析方法，其特征在于，所述成熟培养基中含有高糖dmem培养基、10% 胎牛血清、1%青/链霉素和5 µg/ml胰岛素。
5.根据权利要求2所述的单颗脂滴水平或单细胞水平解析的...
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