【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法。
技术介绍
1、除人类和哺乳动物外，蛋鸡脂肪肝出血综合征发病率高达30％，患病蛋鸡常伴有肥胖、产蛋率降低、腹部或皮下脂肪堆积，甚至内出血导致死亡等情况，对家禽业造成了严重经济损失。为了探究脂肪肝的分子机制，并减少其发病率和死亡率，迫切需要建立合适的代表性模型以进行后续研究。
2、目前肝脏类器官有三种类型的细胞来源，包括干细胞、癌细胞系和原代细胞。来自原发性肝癌细胞的类器官表现出类似于体内癌症的组织学形态，大多数癌细胞系可携带基因异常，主要用于模拟原发性肝癌和结肠癌肝转移。由于肝原代细胞不需要广泛的重编程和分化，对于快速和高通量的药理学研究更加方便和经济。与干细胞和癌细胞系来源的类器官相比，原代肝细胞来源的类器官保留了更多与供体肝脏相同的功能，其基因中携带的碱基替换比诱导多能干细胞少10倍，同时还保留了供体特异性的特征。研究表明，原代肝细胞来源的器官组织在药物代谢和毒性测试中表现出更高的生理相关性，不仅在基因表达谱上更接近原始肝脏组织，而且具有更复杂的肝脏功能，如胆汁合成和脂质代谢等。这使它们成为研究肝脏疾病和开发新药的重要工具。
3、近年来，研究人员已经建立了一些体外模型，能够充分再现肝脏的特性。传统的二维肝细胞培养技术较为简单且具有成本效益，可用于探究细胞分子机制以及药物疗效，但二维细胞通常难以再现体内细胞的结构、功能和生理特性。传统培养皿中培养肝细胞会迫使细胞在培养皿塑料表面上生长，会影响其重要代谢途径，导致细胞骨架变化，并
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，为了解决蛋鸡脂质沉积模型建立困难的技术问题，本专利技术目的是提供一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，验证了1日龄蛋鸡肝脏组织脂质合成和转运相关功能更加活跃，所分离出的肝脏类器官及肝脏原代细胞呈现同样趋势，肝脏存在脂质沉积。因此，选用1日龄蛋鸡肝原代细胞所培养的类器官作为一种天然体外脂质沉积模型，通过分离1日龄蛋鸡原代肝细胞，并对类器官接种及培养技术进行改进，成功构建了一种原代肝细胞来源的蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案是：
3、一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)取蛋鸡肝脏，剔除系膜和胆囊，转移至含2％青链霉素的预冷pbs中，清洗2～3次，直至pbs清澈；
5、(2)将步骤(1)处理获得的蛋鸡肝脏组织置于离心管，加入500μl含2％青链霉素的pbs，剪为肝脏组织碎片；
6、(3)将步骤(2)获得的肝脏组织碎片转入新的离心管中，用含2％青链霉素的pbs自然沉降清洗所述肝脏组织碎片2～3次，4℃，700rpm，离心3min，收集肝脏组织碎片；
7、(4)将步骤(3)获得的肝脏组织碎片转移至含10ml肝解离液的离心管，37℃水浴消化30min，期间每隔10min取出离心管，用力上下摇晃30s；消化结束后，用力上下摇晃30s，收集带有肝细胞的消化液；
8、(5)将步骤(4)收集的带有肝细胞的消化液用70μm细胞滤网过滤，将滤液转移至新的离心管，4℃，1500rpm，离心5min，收集肝细胞沉淀，去除消化液；
9、(6)用7ml含1％青链霉素的advanced dmem/f12重悬步骤(5)获得的肝细胞沉淀，4℃，1500rpm，离心5min，收集新的肝细胞沉淀，重复2～3次直至洗净，获得洗净的肝细胞；
10、(7)用生长培养基重悬步骤(6)获得的洗净的肝细胞，细胞悬液浓度约为600,000个/ml，加入预冷的基质胶充分混合均匀，每孔接种50μl至24孔培养板培养孔中央；
11、(8)将步骤(7)制备的培养板放入细胞培养箱，静置30min，待基质胶凝固后，每孔加入500μl含1％青链霉素的hepaticulttm类器官生长培养基，放入细胞培养箱；
12、(9)每隔3d对蛋鸡肝脏类器官换液，获得蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型。
13、优选的，
14、所述步骤(1)蛋鸡肝脏采用1日龄蛋鸡肝脏。
15、优选的，
16、所述步骤(4)中，肝解离液的组分包括：125μl/ml collagenase type iv(1mg/ml)、125μl/ml dispase(1u/ml)、750μl/ml advanced dmem/f-12、15μl/ml hepes(1m)和10μl/ml青链霉素混合液(100×)。
17、优选的，
18、所述步骤(2)中的组织碎片大小为0.5mm3。
19、优选的，
20、所述步骤(7)中，所述24孔培养板接种前于37℃细胞培养箱预热30min。
21、优选的，
22、所述步骤(7)中生长培养基和基质胶的比例为1:2。
23、优选的，
24、所述步骤(7)中蛋鸡肝脏类器官的培养数量为10,000个/孔。
25、优选的，
26、所述步骤(8)中培养箱温度为37℃，co2含量为5％。
27、本专利技术的有益效果是：
28、本专利技术提供的蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，含有内源脂质沉积，具有更高的脂代谢活性，与传统外源添加脂肪酸的方法相比，降低了研究成本，避免了类器官质量下降，为蛋鸡脂代谢的研究提供了理想的体外模型，为鸡肝脏脂代谢及相关疾病机制的研究奠定基础。
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1.一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，
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【技术特征摘要】
1.一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的一种蛋鸡肝脏类器官天然脂质沉积模型的构建方法，其特征在于，
<...【专利技术属性】
技术研发人员：杨小军，王译彬，侯起航，刘瑞，刘艳利，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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