【技术实现步骤摘要】
本申请涉及椰子组织培养，特别是涉及一种椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法。
技术介绍
1、在椰子体胚发生的技术中，花药培养和小孢子培养，花药培养因其简便性而更为常用。在花药培养中，使用花的雄性生殖器官-花药，并诱导其中封闭的雄性配子前体细胞分裂，形成多细胞胚胎，从而生成幼苗。相比于在胚珠中使用雌性配子前体，使用花药的主要优势在于花药中雄性配子前体的数量更为丰富，且花药中体细胞组织量较小，能够减少非必要体细胞胚的形成。化学胁迫处理已被证明是雄性胚发生诱导的重要组成部分，它们通过阻断配子体发育并在有能力的小孢子中触发胚胎发生。培养基的成分，尤其是生长调节剂、抗褐化剂和活性炭的存在，对椰子花药培养的成功起着关键作用。椰子被普遍认为是极难进行离体培养、组织培养或胚状体发生的物种，花药或离体小孢子中产生单倍体植物的成功率极低。目前褐化是在此过程中影响体胚诱导过程最严重的问题。亟需解决此问题并提升椰子小孢子体胚诱导率。
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请提供一种椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，该方法可以对抗褐化现象，提高椰子小孢子体胚诱导率，能够有效克服上述现有技术所存在的缺陷。
2、本申请提供一种椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，包括以下步骤：
3、s1、花药采集与预处理：选择椰子树冠上最新开放的花序作为1号花序，并按照花序开放顺序依次命名2号花序、3号花序、4号花序以此类推，在1号花序开放1周后，使用手锯，从根部完整采集4号花序，并迅速喷洒柠檬酸溶液，然
4、s2、花药观察、消毒与分离：在预处理后，打开聚丙烯袋，并剔除外皮褐化、萎蔫、外皮开裂的雄花粒，对花药进行观察，待观察到成熟球状小孢子后，则取出健康新鲜、呈乳白色、长度为5-7mm的雄花粒进行消毒处理，消毒完毕后放入铺有滤纸的玻璃培养皿并晾干，进行外植体切割处理，将切出的花药的创口再次蘸取柠檬酸溶液，放在铺有滤纸的玻璃培养皿晾干备用；
5、s3、花药培养与胚胎培养：将10-20个花药背面朝上，创口向下插入m1培养基的培养皿中进行第一次培养，并露出一半方便观察，待体胚突破花药壁露出培养基表面后，将体胚转移到m2培养基进行第二次培养，待长出成熟不透明小芽后移至光环境中进行植株培养。
6、本申请首先使用了聚乙烯吡咯烷酮（pvp），在正常浓度范围内pvp在椰子组织培养中一般没有明显的毒性，在本申请中主要起到抗褐化的作用。它能够吸附植物组织培养过程中产生的酚类等有害物质，减少这些物质对植物细胞的毒害，从而提高外植体的成活率和培养效果。
7、在椰子组培中，褐化现象主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质，将其氧化为棕褐色的醌类物质而引起的。柠檬酸可以与多酚氧化酶活性位点结合，改变其构象，从而抑制该酶的活性，减少酚类物质被氧化的机会，降低褐化程度。同时柠檬酸具有一定的抗氧化能力，可以与氧化反应过程中产生的自由基结合，阻止自由基对植物细胞的损伤，从而减轻褐化现象。它能够在一定程度上保护植物细胞内的生物大分子，如蛋白质、核酸等，使其免受氧化应激的影响，维持细胞的正常生理功能。
8、鉴于植物培养基ph调节一般使用盐酸等酸性物质，本申请使用了抗坏血酸（维生素c）作为ph调节剂。抗坏血酸（维生素c）在本申请中与吸附剂、其他抗氧化剂协同工作。抗坏血酸可以清除细胞内的活性氧，减轻外植体的氧化损伤，间接减少褐化的发生。活性炭、pvp等吸附剂可以吸附培养基中的褐化物质，但对于一些已经发生的褐化反应可能效果有限。抗坏血酸与其他抗氧化剂、吸附剂协同使用时，抗坏血酸可以在早期抑制褐化反应的发生，而活性炭则可以吸附已经产生的褐化物质，两者共同作用，能更有效地对抗褐化。
9、本申请的苯基脲衍生物tdz（n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲，噻苯隆）能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能。此外，tdz通过调节内源植物生长激素起作用，或者是诱导逆境产生起间接作用。它还能调节细胞膜结构、能量水平、营养吸收和同化作用。
10、优选地，步骤s3中，所述m1培养基中含有：tdz 0.5 mg/l、蔗糖120g/l或12%（w/v）、抗坏血酸100 mg/l、pvp 5g/l或0.5%（w/v）、琼脂7g/l、硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、硫酸镁370mg/l、氯化钙440mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l，其ph值为5.75。
11、优选地，步骤s3中，所述m2培养基中含有：6-苄基腺嘌呤5 μm、赤霉素0.5 μm、抗坏血酸100 mg/l、pvp 5g/l或0.5%（w/v）、琼脂7g/l、硝酸钾1900mg/l、硝酸铵1650mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、硫酸镁370mg/l、氯化钙440mg/l、碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、钼酸钠0.25mg/l、硫酸铜0.025mg/l、氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l，其ph值为5.75。
12、优选地，步骤s1中，所述将小穗进行预处理的具体过程为：将小穗在流动自来水下并加入洗涤剂进行冲洗，去除灰尘杂质；然后将小穗分为顶部、中部和底部，只取中部30%的部分，并用75%乙醇喷雾喷洒后干燥。
13、优选地，步骤s1中，所述培养箱的温度设置为38°c，湿度设定为90%。
14、优选地，步骤s2中，所述观察的具体过程为：取少量花药在光学显微镜下用4%醋酸洋红压片，观察花药释放的小孢子发育阶段。
15、优选地，步骤s2中，所述消毒处理的具体过程为：用洗洁精清洗雄花粒表面污渍，不破坏其花萼，再用自来水冲洗5分钟，随后移入灭菌后的超净工作台，每10颗雄花粒放入30ml的75%乙醇溶液中，摇匀消毒90秒，并将其放在21g/l或2.1%（w/v）次氯酸钙溶液中振荡消毒12分钟，用无菌去离子水冲洗三次，用滤网过滤后放入铺有滤纸的玻璃培养皿并晾干。
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【技术保护点】
1.一种椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S1中，所述将小穗进行预处理的具体过程为：将小穗在流动自来水下并加入洗涤剂进行冲洗，去除灰尘杂质；然后将小穗分为顶部、中部和底部，只取中部30%的部分，并用75%乙醇喷雾喷洒后干燥。
3.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养箱的温度设置为38°C，湿度设定为90%。
4.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S2中，所述观察的具体过程为：取少量花药在光学显微镜下用4%醋酸洋红压片，观察花药释放的小孢子发育阶段。
5.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S2中，所述消毒处理的具体过程为：用洗洁精清洗雄花粒表面污渍，不破坏其花萼，再用自来水冲洗5分钟，随后移入灭菌后的超净工作台，每10颗雄花粒放入30mL的75%乙醇溶液中，摇匀消毒90秒，并将其放在21 g/L
6.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S2中，所述外植体切割处理的具体过程为：将200 mg/L的无菌柠檬酸溶液置于玻璃培养皿上，液面距底部2mm，在60倍显微镜下，使用一次性手术刀小心拨开并去除雄花的三片花萼并打开花蕾，用细尖镊子将花药从花丝上分离，在化药根部切断花丝组织，且少留创口。
7.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤S3中，所述第一次培养的具体条件为：用封口膜密封培养皿，在27-28°C黑暗条件下培养8-10个月；或
8.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，所述植株培养的具体条件为：采用每天16小时光照、8小时暗处理的光周期，25μmol m-2 s-1的光照强度进行植株培养。
...【技术特征摘要】
1.一种椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤s1中，所述将小穗进行预处理的具体过程为：将小穗在流动自来水下并加入洗涤剂进行冲洗，去除灰尘杂质；然后将小穗分为顶部、中部和底部，只取中部30%的部分，并用75%乙醇喷雾喷洒后干燥。
3.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤s1中，所述培养箱的温度设置为38°c，湿度设定为90%。
4.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤s2中，所述观察的具体过程为：取少量花药在光学显微镜下用4%醋酸洋红压片，观察花药释放的小孢子发育阶段。
5.根据权利要求1所述的椰子小孢子体胚培养过程中的抗褐化方法，其特征在于，步骤s2中，所述消毒处理的具体过程为：用洗洁精清洗雄花粒表面污渍，不破坏其花萼，再用自来水冲洗5分钟，随后移入灭菌后的超净工作台，每10颗雄...
【专利技术属性】
技术研发人员：穆治华，罗杰，维吉塔罗西尼马德里库马里维德哈那拉齐，玛拉瓦谭斯丽格奈普利因迪拉查帕，塞纳拉斯帕斯兰那赫拉齐那沃蒂尼查素丽卡加亚拉斯那，杨壮，周骏杰，肖勇，夏薇，刘贤青，
申请(专利权)人：海南省种业实验室，
类型：发明
国别省市：
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