【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一种根瘤菌胞外多糖及其对肝癌细胞抑制作用方面的用途。
技术介绍
1、胞外多糖（exopolysaccharide, eps）是一类由十个或更多单糖通过糖苷键连接而成的大分子碳水化合物。它们在自然界中广泛存在，既可以是直链也可以是分支链，eps可以根据其化学结构被分类为同多糖和杂多糖两大类。同多糖：例如葡聚糖，由单一类型的单糖单元组成，其合成过程主要在细胞外进行，依赖于如蔗糖这类特定的底物，糖链分别作为糖基供体、糖基受体，还需要聚糖蔗糖转移酶参与合成。杂多糖：是由两种或多种不同的单糖聚合而成规则的重复单元，例如黄原胶。杂多糖的生物合成主要包括细胞质内前体的产生、重复单元的合成以及胞外重复单元的聚合过程。eps在生物体中扮演着多种重要角色，包括储能、细胞识别、细胞信号传导以及作为细胞结构的一部分等。在医学和生物学领域，多糖因其独特的生物学功能和潜在的医疗价值而受到广泛关注。eps还作为抗肿瘤、抗病毒和抗炎剂参与人类的各种生理活性，并且可以作为干扰素、血小板聚集抑制和集落刺激因子合成的诱导剂。
2、胞外多糖在自然界分布十分广泛，对细菌的生存、适应环境、以及与宿主之间的相互作用中发挥着关键作用。eps的组成、结构和功能多样性反映了细菌在不同环境下的适应性和生物多样性。eps的化学组成和结构非常多样，主要包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖组成，以及它们的衍生物。这种多样性使得eps具有广泛的物理和化学特性，从而能够在不同的环境条件下发挥作用。有些细菌可在体内合成胞外多糖并分泌
技术实现思路
1、本专利技术的目的主要是解决上述现有问题，提供一种根瘤菌胞外多糖及其用途。通过提取并纯化根瘤菌胞外多糖，分析胞外多糖的产量和单糖组成，进而系统性的研究胞外多糖对体外肝癌细胞hep-g2的凋亡作用机制。构建小鼠肝癌模型，以模型组为阴性对照，特效药物组为阳性对照，肝癌小鼠模型采用浓度梯度胞外多糖灌胃作为实验组，分析胞外多糖对肝癌裸鼠血液和肿瘤样本的转录组学影响。通过肝肾毒性测试、elisa实验、he染色和免疫组化实验等多种手段，对胞外多糖在hep-g2皮下模型中的作用效果进行全面表征，采用western blot实验探明胞外多糖对裸鼠肝癌肿瘤关键蛋白的调控机制。
2、上述目的是由以下技术方案实现的：
3、一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
4、该根瘤菌胞外多糖分子量为691.01kda，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成，半乳糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸的摩尔比为17.45∶67.06∶14.50∶0.99。
5、进一步地，所述胞外多糖由保藏号为cgmccn0.7895的杨凌根瘤菌（ rhizobium yanglingense）生产获得。
6、进一步地，所述胞外多糖经制备方法的s2：大孔树脂纯化后的总糖纯度至少为57.2%（质量分数），再经s3：凝胶纯化后的多糖总糖纯度至少为84.5%（质量分数）。
7、进一步地，所述胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：
8、s1：胞外多糖粗多糖的提取方式：
9、（1）将筛选的菌株定量接入yma液体发酵培养基中，28℃过夜无菌摇床培养至稳定期；
10、（2）将培养的根瘤菌发酵液离心去除菌体，旋转蒸发浓缩至一定体积后加入4倍无水乙醇过夜醇沉，离心收集沉淀部分，去离子水透析48 h，进行真空冷冻干燥得粗多糖；
11、s2：胞外多糖的大孔树脂纯化：
12、（1）将冻干后的样品研磨粉碎并过100目筛；
13、（2）加入适量无水乙醇，搅拌萃取脂溶性色素和部分杂质，6000×g离心10 min，收集沉淀；
14、（3）向沉淀中加入适量纯水，55℃恒温水浴提取3 h，而后去除于6000×g离心10min，收集上清提取液后离心管内沉淀残渣按照上述步骤复提一遍；
15、（4）将两次收集到的提取液合并，真空转蒸发浓缩至原体积的1/10后加入四倍无水乙醇4℃过夜醇沉；
16、（5）8000×g离心10 min收集沉淀固体，即粗多糖提取物；
17、（6）向固体中加入适量纯水和少量木瓜蛋白酶，过夜酵解；
18、（7）向水相中加入sevage试剂，充分混匀，收集上层水相；
19、（8）向液体中加入适量石油醚，充分混匀，收集下层水相；
20、（9）向水相中加入适量大孔树脂ab-8，充分混匀，过夜吸附；
21、（10）收集液体，3000 da透析袋透析48 h除去小分子组分，多糖液冷冻干燥；
22、（11）采用苯酚—硫酸法测定粗多糖的可溶性总糖含量及纯度，具体操作为：准确称取少量多糖冻干粉，加水溶解后，加入硫酸—苯酚试剂，避光反应10 min，在od490nm处测定吸光度；
23、s3：胞外多糖的凝胶纯化：
24、（1）取离子纯化后的多糖样品加入纯水，配成浓度15 mg/ml的多糖母液，于10000×g离心10 min，取上清液，用凝胶层析柱分离纯化，流速1 ml/min：采用纯水洗脱1.5倍柱体积，每12 ml收集一管，收集所有洗脱液；
25、（2）采用硫酸-苯酚法测定各收集管中洗脱液的总糖含量，并绘制凝胶纯化洗脱曲线；
26、（3）选择并确认洗脱峰（默认选择主峰）；
27、（4）合并同一个洗脱峰对应的各收集洗脱液，旋蒸浓缩至原体积的1/5；
28、（5）冷冻干燥，并采取硫酸—苯酚法鉴定凝胶纯化后多糖的含量和纯度等。
29、一种根瘤菌胞外多糖的用途，其特征在于：
30、所述胞外多糖在制备用于具有肝癌细胞抑制作用相关药物的应用。
31、胞外多糖灌胃不会引起alt（丙氨酸转氨酶）、ast（天冬氨酸转氨酶）、alp（碱性磷酸酶）和胆红素水平的波动并维持在正常水平，证明胞外多糖不会损伤肝肾组织，对小鼠无毒。
32、胞外多糖可显著降低afp（甲胎蛋白）、cea（癌胚抗原）和ca199等癌症标志物水平，显著上调mapk信号通路的myd88、cd14、tnf-ɑ、jun、tgf-β1、tlr4、mcsf、p53、bcl-2基因和蛋白表达量，肿瘤细胞出现溶解、炎性细胞浸润、细胞体积小、细胞核固缩、组织坏死区域增多、空泡变性、细胞死亡等现象，表明胞外多糖促进肿瘤细胞的凋亡速度，对小鼠肝癌具有较强的抑制作用。
33、本申请探究了根瘤菌源细菌胞外多糖（eps）对hep-g2肝细胞癌系及裸鼠肝癌模型的抑制效应和生物安全性，特别关注其本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
5.根据权利要求3或4所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
6.根据权利要求1至4任一项所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的一种根瘤菌胞外多糖，其特征在于：
4.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：冀照君，袁晓霞，赵家齐，李华，申奥龙，
申请(专利权)人：内蒙古民族大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。