松果提取物及其应用制造技术

制备松果提取物的方法，和通过所述方法制备的松果提取物，其中所述松果提取物可用于提高核酸疫苗和药物的作用，并且可用于制备表型不成熟和／或成熟的树状细胞和／或纤维细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般涉及松果提取物的制备，松果提取物自身及其应用，特别是作为佐剂在脊椎动物的接种或治疗中的应用，以及作为促进血细胞分化的活性剂的应用。
技术介绍
随着研究人员对于脊椎动物免疫系统的了解不断增多，人们正在不断地寻找用以利用和具体采用免疫系统来预防和对抗疾病的方法。由于免疫系统超常的易变性，这类方法原则上提供了对于具有足够大小的任何物质起反应的可能性。因此，已作了很多尝试来建立癌症、细菌和病毒感染的接种和/或免疫治疗方法。这样的治疗或接种方法通常是把欲治疗的生物体暴露于(体内治疗)抗原性物质的疫苗制剂，以产生免疫反应。特别是，使用抗原性物质(抗原)来引发能够探测到抗原性物质自身或其部分(表位)的免疫球蛋白和/或细胞毒性噬吞细胞的产生，由此它们变得可迅速被免疫系统识别。具有如此性质的抗原变得可被迅速识别，并且可以被灭活或破坏，例如被摄入到T细胞内，之后被分解，或者被包含抗原的细胞破坏。类似的接种或治疗方法是从欲治疗的生物体中提取淋巴细胞，特别是淋巴干细胞，把提取的细胞暴露于抗原，由此诱导能够探测到抗原的免疫球蛋白的产生，然后把能产生免疫球蛋白的淋巴细胞再输入到欲治疗的生物内(体外治疗)。术语“接种”是指通过产生、提高或维持免疫系统对与疾病或疾患有关的抗原起反应的能力，来治疗脊椎动物，以主要是预防疾病或病患。术语“治疗”是指在疾病或病患的首次发作之后，产生、提高或维持免疫系统对与疾病或疾患有关的抗原起反应的能力，因此在性质上是治疗的。接种治疗中的活性组分称为“疫苗”，而治疗性治疗中的活性组分称为“药物”。术语“接种”和“治疗”可互换使用，术语“疫苗”和“药物”亦是如此。过去十年当中最重要的科学发现之一是确定了被人T细胞识别的肿瘤相关抗原(TAA)。关于其综述可参见例如Robbins和Kawakami“被T细胞识别的人肿瘤抗原”，Current 0pinion in Immunology 1996，8628-636；Rosenberg SA，“基于编码癌抗原的基因的癌症免疫治疗的新纪元”，Immunity 1999，10281-287；Van den Eynde BJ和van der Bruggen P，“T细胞确定的肿瘤抗原”，Current Opinion inImmunology 1997，9684-693。广泛认为TAA的鉴定和分子特征确定能够提供产生癌疫苗的手段。目前在专利技术这类疫苗方面的努力是基于核酸介导的免疫技术，即将一个或多个抗原编码序列(例如TAA编码序列)插入到合适的表达(宿主)载体中，这样的载体能够引起抗原编码序列直接在转染的细胞中表达。在下文中，术语“序列”是指特征在于其核苷酸序列的核酸，其中核酸是包含一个或多个选自下列的核苷酸的任何分子腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其功能同等物例如肌苷和次黄嘌呤，其中每个核碱基连接在包含戊糖例如核糖和/或脱氧核糖，其它糖或氨基酸的骨架上，并且其中各个骨架通过例如磷酸二酯键、肽键或其它合适的连接/连结手段彼此连接/连结在一起。核酸的实例是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。常用的宿主载体是细菌和病毒或者细菌和病毒基因组。最近的研究已经表明，对于疫苗制剂，并不总是需要细胞或包囊的载体。用“裸”质粒DNA和/或用RNA，即用没有任何其它结构组分例如蛋白、脂质或糖类的核酸进行免疫接种，可引起强有力的细胞和抗体反应。因此，也称为重组疫苗的核酸疫苗是这样的疫苗，其中宿主载体的基因组整合—经常是异源的—编码免疫原(抗原)的核酸序列、与基于细胞的疫苗或细胞裂解物相比，重组疫苗具有很多优点，最显著的优点可能是，它们可使免疫反应集中于抗单一、特异性抗原例如TAA，由此限制了释放出对抗存在于正常组织和肿瘤细胞中的迄今为止仍未知的抗原的失控自身免疫攻击的可能性。目前接种和治疗成功在不同疾患之间，甚至对于相同疾患，在所治疗的患者之间具有很大差异。此外，接种不能总是长时间令人满意，但是可能在数周内逐渐减弱。对于可特别包括施用活体或灭活疫苗的多种其它接种方法，也存在这些缺陷。疫苗通常不能总是通过自身来产生合适且有效的免疫反应。当与特异抗原一起施用时，一些物质将提高对该抗原的免疫反应。灭活或纯化的抗原疫苗中通常包括这样的物质(佐剂)。常用佐剂的实例有铝盐、脂质体和免疫刺激复合物(ISCOMS)、完全和不完全弗氏佐剂、胞壁酰二肽和细胞因子例如白介素(IL)2、IL-12和干扰素(IFN)γ。虽然某些佐剂非常适于与特异抗原或疫苗联合使用，但是它们可能在其它组合中不起作用，或者它们自身对于脊椎动物例如人可能有毒性，促进不良的细胞介导的免疫性，不稳定，或者很昂贵和/或制备复杂。因此，用于接种和治疗脊椎动物疾病和疾患的改进的方法将非常有用。另一个方面是，对于科学目的，经常需要产生特定细胞类型，以例如用于组织培养。在研究所需的细胞类型当中，有树状细胞和最近发现的纤维细胞。树状细胞是有效的抗原呈递细胞。据报道，它们还起混合淋巴细胞反应的刺激剂的作用，经由组织选择性地迁移，摄取、加工和呈递抗原，以及作为信使细胞引起移植组织的排斥反应。关于综述参见例如Hart DNJ“树状细胞控制初次免疫反应的独特白细胞群体”，Blood，1997，903245-3287。显然，在希望正确识别抗原和产生免疫反应的任何领域，树状细胞的研究提供了可能的应用。这样的领域是例如移植用药物，接种，癌症以及与抗原呈递有关的其它疾病的治疗，自身免疫性疾病的预防和治疗等，参见例如Dallal RM和Lotze MT，“树状细胞和人癌症疫苗”，Current Opinion in Immunology，2000，12583-588。然而，对树状细胞及其分化的了解尚不充分。因此希望有能制备树状细胞的方法。目前生成树状细胞的方法依赖于从外周血液单核细胞、骨髓细胞或其它CD34+细胞分化，这是通过将这样的细胞暴露于包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、肿瘤坏死因子α(TNFa)、肿瘤生长因子β(TGFβ)和IL-4的多种细胞因子组合而实现的。关于综述可参见例如Strunk D等人，“从循环CD34+造血祖细胞生成人树状细胞/朗氏细胞”，Blood，1996，871292-1302和SoligoD等人，“在静态和连续灌注培养物中扩展衍生自人CD34+细胞的树状细胞”，British Journal of Hematology，1998，101352-363。同样，已经从CD14+血液单核细胞中制备了树状细胞，并描述了不同的成熟阶段。关于综述参见Winzler C等人，“在依赖于生长因子的长期培养基中鼠树状细胞的成熟阶段”，Journal of Experimental Medicine，1997，185317-328以及Crawford和Chester的US专利US6,194,204 B1。仍然，目前的方法依赖于昂贵且不稳定的细胞因子培养基组分。另外，目前制备树状细胞的方法的收率通常非常低而不能令人满意。纤维细胞是最近描述的特征在于其不同表型(胶原+，CD34+)的细胞类型，其通常也是波形蛋白+(vimetin+)、CD13+和CD45+。据报道，它们迅速从血液中进入皮下移植的伤口本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备松果提取物的方法，所述方法包括下列步骤：ａ）用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；ｂ）除去平均粒径大于０．２μｍ的颗粒物，获得了上清液；ｃ）将所得上清液的ｐＨ调节至６．０－８．０，其特征在于， 所述方法还包括下列步骤：ｄ）将上清液过滤以获得保留级份；ｅ）排放出保留级份，除去平均分子量小于３０ｋＤａ的颗粒；和ｆ）将保留级份悬浮在ｐＨ为６．０－８．０的包含氢氧化钾的水溶剂中。

【技术特征摘要】
US 2001-9-26 09/964,2401.制备松果提取物的方法，所述方法包括下列步骤a)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；b)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；c)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0，其特征在于，所述方法还包括下列步骤d)将上清液过滤以获得保留级份；e)排放出保留级份，除去平均分子量小于30kDa的颗粒；和f)将保留级份悬浮在pH为6.0-8.0的包含氢氧化钾的水溶剂中。2.通过权利要求1的方法制备的松果提取物。3.用于接种和/或治疗的系统，其中包括组合物或药盒，所述组合物或药盒包含a)疫苗或药物，和b)佐剂，其中所述佐剂包含松果提取物。4.权利要求3的系统，其中所述疫苗或药物是核酸疫苗或药物。5.权利要求3的系统，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物a)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；b)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；和c)将所得水溶液的pH调节至6.0-8.0。6.权利要求5的系统，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物e)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；f)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；g)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0，其特征在于，所述方法还包括下列步骤h)将上清液过滤以获得保留级份；e)排放出保留级份，除去平均分子量小于30kDa的颗粒；和f)将保留级份悬浮在pH为6.0-8.0的包含氢氧化钾的水溶剂中。7.接种或治疗脊椎动物的方法，所述方法包括下列步骤a)给脊椎动物施用疫苗或药物；和b)给脊椎动物施用松果提取物。8.权利要求7的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：田中昭子，约翰杰西普，威廉盖伊布雷德利，
申请(专利权)人：田中昭子，约翰杰西普，威廉盖伊布雷德利，
类型：发明
国别省市：US[美国]