一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法技术

一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，包括以下步骤：步骤1：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法对大肠杆菌基因组进行定向改造，定向改造包括以下内容：a.敲除核苷酸酶基因（yfbR/yfdR/ushA/umpH/umpG/yjjG），阻断dUMP降解为dU的路径；b.在假基因位点mbhA整合大肠杆菌内源的尿苷激酶基因tdk，强化dU的磷酸化路径；c.在假基因位点yeeP整合大肠杆菌内源的dUMP激酶基因tmk，强化dUMP的磷酸化路径。本发明专利技术提供一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，该方法的转化率达到80%~90%，经离子交换层析纯化后，纯度可达99%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，具体涉及一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法。

技术介绍

1、核苷及其衍生物在细胞代谢中起着重要作用，广泛应用于医药、食品和科学研究。其中，脱氧核苷-5′-三磷酸盐（dntps）是dna合成中的重要前体，是分子生物学研究中不可或缺的试剂。聚合酶链反应（pcr）和其他用于dna合成的pcr应用需要脱氧核苷三磷酸盐（dntp）作为必需的前体和底物。dntp有四种成分：脱氧腺苷三磷酸（datp）、脱氧胞苷三磷酸（dctp）、去氧鸟苷三磷酸（dgtp）和脱氧胸苷三磷酸（dttp）。由于生物技术研究界和工业界对dna生物合成的pcr应用越来越多，对dntp的需求正在稳步增加。

2、传统上，dntp是化学合成的。例如，在溶剂中，脱氧核苷被三氯氧磷（pocl3）直接磷酸化，生成相应的脱氧核苷酸。通过该方法合成了许多脱氧核苷酸衍生物。然而，使用化学合成时存在许多挑战，如反应时间长和产率低。此外，主要缺点是缺乏适用于所有核苷的通用方法和繁琐的纯化方案。

3、专利cn1269422a公开了一种脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，以天然dn本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述尿苷激酶基因tdk的基因序列为：

3.根据权利要求1所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述dUMP激酶基因tmk的基因序列为：

4.根据权利要求2或3所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法使用的质粒分别为pTarget和pCas9，其中pCas携带pTarget的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，pT...

【技术特征摘要】

1.一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述尿苷激酶基因tdk的基因序列为：

3.根据权利要求1所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述dump激酶基因tmk的基因序列为：

4.根据权利要求2或3所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述crispr/cas9介导的基因编辑方法使用的质粒分别为ptarget和pcas9，其中pcas携带ptarget的消除系统、λ噬菌体的red重组系统及cas9蛋白表达系统，ptarget包含sgrna序列、n20序列和供体dna片段。

5.根据权利要求4所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述步骤1中核苷酸酶基因（yfbr/yfdr/usha/umph/umpg/yjjg）、核苷三磷酸焦磷酸酶基因（dut）和...

【专利技术属性】
技术研发人员：许仁杰，彭琳，张思，
申请(专利权)人：南京有为生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：