一种5-甲基尿苷生产菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种5‑甲基尿苷生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术在E.coliUR12基因组上,利用人工启动子P<subgt;BBa_j23114</subgt;替换尿苷酸激酶基因pyrH的天然启动子，弱化前体物UMP流向生长方向的分支途径，再通过敲除umpH、umpG和tdk基因，保证菌体生长的同时，加强5‑甲基尿苷积累；异源引入且多拷贝黄素依赖性胸苷酸合成酶基因thyX，过表达碱性磷酸酶基因phoA，协同加强5‑甲基尿苷合成途径；最后，过表达丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA，维持关键酶ThyX的辅酶CH<subgt;2</subgt;‑THF供应，所获得的菌株遗传稳定性好、发酵产率高，可稳定生产5‑甲基尿苷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及代谢工程及基因工程，尤其是一种5-甲基尿苷生产菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

1、现阶段，5-甲基尿苷（5-methyluridine）在医药、化妆品及健康食品行业中有着广泛的应用，尤其是在抗病毒药物、核酸药物前体及功能性添加剂等领域具有重要价值。随着医药工业及健康食品市场的快速增长，5-甲基尿苷的市场需求也在持续扩大。

2、目前工业化生产5-甲基尿苷的方式主要有化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。其中，化学合成法操作复杂，通常需要多步反应，且可能引入有害副产物，对环境污染较大；酶催化法虽具有一定的专一性和效率，但反应过程对原料纯度和酶的活性要求较高，且酶的分离和回收利用具有一定的难度。相比之下，微生物发酵法具有工艺简单、原料易得、成本低、安全性高等优点，有待成为生产5-甲基尿苷的重要发展方向。

3、但目前5-甲基尿苷生产菌株都是携带质粒的，具有遗传稳定性差和生长代谢负担大等缺点，会导致产物的产量极具下降、生产过程难以控制等工业问题。因此构建一株产酸效率高、遗传稳定性好的5-甲基尿苷生产菌种是目前亟待解决的技术问题本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种5-甲基尿苷生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株E.coliUR12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在E.coliUR12基因组上弱化尿苷酸激酶基因pyrH，敲除umpH基因、umpG基因和tdk基因,异源引入绿色产色链霉菌Streptomyces viridochromogenesTü57中黄素依赖性胸苷酸合成酶基因ThyX，过表达碱性磷酸酶基因phoA和丝氨酸羟甲基转移酶基因glyA；其中，

2.根据权利要求1所述的5-甲基尿苷生产菌株，其特征在于：所述umpH基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；umpG基因的核苷酸序列如序列表...

【技术特征摘要】

1.一种5-甲基尿苷生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株e.coliur12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在e.coliur12基因组上弱化尿苷酸激酶基因pyrh，敲除umph基因、umpg基因和tdk基因,异源引入绿色产色链霉菌streptomyces viridochromogenestü57中黄素依赖性胸苷酸合成酶基因thyx，过表达碱性磷酸酶基因phoa和丝氨酸羟甲基转移酶基因glya；其中，

2.根据权利要求1所述的5-甲基尿苷生产菌株，其特征在于：所述umph基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；umpg基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；tdk基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。

3.权利要求1或2所述5-甲基尿苷生产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

4.权利要求1或2所述5-甲基尿苷生产菌株在发酵生产5-甲基尿苷方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：使用摇瓶发酵生产5-甲基尿苷，具体步骤如下：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述种子活化及培养中采用的斜面培养基为：葡萄糖2 g/l，蛋白胨10 g/l，酵母粉5 g/l，氯化钠2.5 g/l，kh2po4 1.0 g/l，mgso4 0.2g/l，琼脂粉25%，其余为水，ph 7.0-7.2；所述种子培养基为：酵母粉8.0 g/l，蛋白胨2.0 g/l，(nh4)2so42.0 g/l,kh2po4 3.0 g/l，vb1、vb2、vb3、vb5、vb12各2 mg/l，vh 1 mg/l，mgso4·7h2o0.5 g/l，钼酸铵0.32 mg/l，硼酸4.5 mg/l，cocl2·6h2o 1.6 mg/l，其余为水；所述发酵培养基为：酵母粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，李长庚，赵润泽，范文静，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：