具有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的咖啡植物制造技术

本发明专利技术涉及通过降低α－Ｄ－半乳糖苷酶活性的内源性水平对生咖啡豆中存在的半乳甘露聚糖的修饰。具体地说本发明专利技术涉及具有降低的α－Ｄ－半乳糖苷酶活性的植物细胞和含有该植物细胞的植物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及通过降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平而修饰生咖啡豆中存在的半乳甘露聚糖。具体地说本专利技术涉及具有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的植物细胞和含有该植物细胞的植物。在咖啡粒中，细胞壁多糖占成熟咖啡豆干重的大约48％，其中甘露聚糖占大约一半。这些多糖的纯化形式基本上是不溶的并且具有很低的半乳糖分支(Bradbury和Haliday，农业食品化学杂志(J.agric.Food Chem.)38(1990)，389-392)。认为甘露聚糖聚合物是在制备可溶性咖啡饮料时造成原来的生咖啡重量大量损失的主要原因。这些损失出现在最初提取时不溶解的物质仍为沉淀或在咖啡溶液贮存时产生沉淀和凝胶形式。甘露聚糖也显示是咖啡饮料放置期间形成混浊和沉淀的主要组分。在一些植物中，认为甘露聚糖链上的半乳糖支化度部分取决于α-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)的活性。该酶能从贮存在植物种子贮藏组织或成熟的半乳甘露聚糖释放α-1，6-连接的半乳糖单元(Buckeridge和Dietrich，植物科学(Plant Sci.)117(1996)，33-43)。并且，在一些植物的胚乳或子叶组织中具有很低半乳糖/甘露糖比率的半乳甘露聚糖的累积显示出与这些组织成熟期间α-D-半乳糖苷酶活性高峰相关，并且与其硬化和干燥有关(Kontos和Spyropoulos，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)34(1996)，787-793)。α-D-半乳糖苷酶活性也与去除和半乳甘露聚糖多糖以α-1，6-连接的半乳糖残基的能力有关，该活性导致所述聚合物的溶解性降低(McCleary，Carb.Res.92(1981)，269-285)。此外，从半乳甘露聚糖去除半乳糖侧链似乎增强它与其它多糖相互作用的能力，例如与瓜尔豆中的黄原胶相互作用，伴随复合胶的形成。在成熟过程中，咖啡粒甘露聚糖上的半乳糖分支从未成熟粒中的大约40％降低到在成熟粒中以低水平存在。同时，在咖啡粒成熟过程中α-D-半乳糖苷酶的酶活性增强。已经克隆了咖啡的α-D-半乳糖苷酶cDNA(Zhu和Goldstein，基因(Gene)140(1994)，227-231)。根据由其获得的信息推断成熟咖啡豆α-D-半乳糖苷酶由363个氨基酸组成，并合成为420个残基的前酶原。生物合成后，两个蛋白酶切割去除一个分泌信号(38个残基)和另一个信号肽(19个残基)，以产生显示有活性酶的N-末端氨基酸序列特征的蛋白质。由于已知半乳甘露聚糖对可溶性咖啡的制备和/或耐贮性的作用，需要在本领域中改善这种状况。因此，本专利技术的一个目的是提供制备可溶性咖啡的改良方法，并同时避免贮存咖啡溶液时公知的缺陷。以上问题通过分别提供其中半乳甘露聚糖的半乳糖分支增加的咖啡植物细胞、咖啡植物而得到解决。根据一个优选的实施方案本目的可通过降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平而达到。这可使用本领域有用的技术通过突变和筛选的常规方法来达到。因此，可对植物细胞进行诱变处理，例如通过将它们暴露于化学品或辐射使细胞的DNA改变。对这样处理的细胞随后进行筛选以获得所需特性。根据另一个优选的实施方案降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平可通过将包含这样的核酸或其部分的构建体导入到咖啡植物细胞而获得，其中所述的核酸转录为α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的反义拷贝。为了这个目的，α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的反义拷贝可为能在生理条件下形成二聚体的任意核糖核酸，即在细胞的优势条件下其可与α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA杂交。因此，反义拷贝不必与相应的配对物100％同源，但需要提供足够的结合用以形成二聚体。因此，通过核苷酸的替换、缺失和/或插入而修饰的反义拷贝(和由它们转录的相应核酸)均正好在本专利技术的范围内。在这方面，也值得一提的是反义拷贝可代表α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA的全长配对物，即它可提供与编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA基本上具有相同长度的RNA分子。另一方面，反义拷贝可只覆盖编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA的一部分。编码如下核糖核酸的核酸可处于组成型或诱导型启动子的控制下，其中所述核糖核酸与α-D-半乳糖苷酶基因编码的mRNA或其部分反义，这样可便于控制反义RNA的水平。但是，在所有的情况下反义拷贝的水平应足够高以至于降低可到达核糖体的编码α-D-半乳糖苷酶多肽的mRNA拷贝数。根据一个优选的实施方案，使用的启动子是产生足够高转录率的咖啡cspl启动子。因此本专利技术分别提供了这样的经修饰咖啡植物细胞和咖啡植物，其中α-D-半乳糖苷酶活性水平降低使最终的半乳-甘露聚糖上半乳糖分支增加。根据一个优选的实施方案该植物为转基因植物，其细胞含有能提供来源于α-D-半乳糖苷酶基因的mRNA或其部分的反义拷贝的构建体。本专利技术也提供了制备可溶性咖啡的方法，它包括使用来源于显示有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的植物的咖啡豆的步骤。在这方面本专利技术也提供了通过增加半乳糖分支增加咖啡可溶性的方法。本专利技术目的在于通过增加半乳-甘露聚糖的半乳糖分支增加咖啡半乳-甘露聚糖的可溶性。所采用的策略是降低α-D-半乳糖苷酶活性的内源性水平，优选地通过在咖啡cspl启动子控制下导入所述酶cDNA的反义拷贝。已经对该csp1启动子的特性进行了描述(Marraccini等人，植物生理生化(Plant Physiol.Biochem.)37(1999)，273-282)，该启动子调控编码咖啡11S贮藏蛋白的基因的表达。构建了包含所述启动子的盒并导入到来源于pTiT37质粒(Bevan，核酸研究(Nucl.Acids Res)12(1984)，8711-8721)的转化用双元载体的T-DNA区。该重组载体导入到用于转化咖啡外植体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)内。将含有插入其基因组的T-DNA的咖啡植物进行再生并分析其咖啡粒中的α-D-半乳糖苷酶活性。I.成熟期间咖啡粒中α-D-半乳糖苷酶活性的分析从温室(温度大约25℃、湿度70％及自然光)中生长的阿拉伯咖啡(Coffea arabica)卡图拉T2308(Caturra T2308)品种成熟的不同阶段(年龄表示为开花后的周数WAF)收获果实。收获后的樱桃样果实于液氮中冷冻并置于-85℃保存直至应用。对于成熟研究，将胚乳和外胚乳组织进行分离。将植物材料在液氮中研碎并用冰冷的酶提取缓冲液(甘油10％ v/v、偏亚硫酸氢钠10mM、EDTA 5mM、MOPS(NaOH)40mM、pH 6.5)以大约20mg每100μl的比例进行提取。混合物置冰上搅拌20分钟，离心(12,000g×30分钟)，分装并置于-85℃保存直至应用。用底物对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷(pNGP)在分光光度计上检测α-D-半乳糖苷酶活性。反应混合物包含200μl在McIlvain′s缓冲液(柠檬酸100mM-Na2HPO4200mM pH 6.5)中的pNGP 100mM，用酶提取物加至终体积1ml。在26℃维持反应，加入酶起始反应以及加入4倍体积的终止液(Na2CO3-NaHCO3100mM pH 10.2)终止反应。在405nm读吸光值。硝基苯基本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生半乳甘露聚糖的咖啡植物细胞，其中半乳糖分支增加。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P马拉奇尼，A德塞，J罗杰斯，
申请(专利权)人：雀巢产品有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]