一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：BAC质粒构建与制备；实验小鼠超数排卵和受精卵收集；受精卵原核显微注射；注射后胚胎移植；基因型鉴定；繁育与遗传分析；用免疫组化及免疫荧光验证人源化免疫系统构建结果。本发明专利技术首次将经sCD27处理的外周血单个核细胞与瘢痕疙瘩周围皮肤(同源细胞与组织)移植入CD70基因过表达的NSG‑MHC‑DKO免疫缺失小鼠体内，避免免疫细胞和组织不同源可能发生的HLA排斥，最大程度地还原瘢痕疙瘩内部微环境及其与免疫系统的相互作用，可实现体外研究免疫因素对瘢痕疙瘩发生发展的影响。本发明专利技术首次发现并验证了CD27‑CD70轴的激活可促进瘢痕疙瘩的发生发展，为抗瘢痕药物的研发特别是免疫治疗提供适合的动物模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及瘢痕疙瘩动物模型领域，具体为一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

1、开发新的治疗方法需要理想的临床前模型，现有动物模型中瘢痕疙瘩的形成依靠诱导或人类瘢痕疙瘩植入。然而，由于人类和动物间存在诸多生理差异，在动物体内诱发的瘢痕组织通常是增生性瘢痕而非瘢痕疙瘩，因此人来源瘢痕疙瘩细胞或组织植入裸鼠体内的模型更为可信。然而随着免疫因素在瘢痕疙瘩发生发展中的重要性逐步被揭示，含有人类免疫细胞重建免疫系统的“人源化”小鼠更适合用于瘢痕疙瘩体内模型，它使研究全身免疫系统和局部因素之间相互作用成为可能。

2、现有技术中提供的裸鼠--瘢痕疙瘩模型缺乏免疫系统支持，移植后的人源化瘢痕疙瘩一般在1个月内体积逐渐缩小，无法有效观察免疫系统与局部瘢痕疙瘩间相互作用的同时各类实验的窗口期均较短，无法有效观察抗瘢痕药物疗效及机制；同时，无法观察免疫因素对瘢痕疙瘩发生发展的影响。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法及其应用，以解决本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中BAC质粒菌种接种到100mL氯霉素抗性LB培养液中，32℃过夜震荡培养16-20h，用质粒提取试剂盒抽提BAC质粒，用限制性内切酶切并进行脉冲场凝胶电泳鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：将鉴定正确的BAC质粒在透析液(浓度为0.5mL的1mol/LTris-HCL,10uL的0.5mmol/L EDTA和1mL的5mol/L NaCl用无菌水定容到50mL)中过...

【技术特征摘要】

1.一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中bac质粒菌种接种到100ml氯霉素抗性lb培养液中，32℃过夜震荡培养16-20h，用质粒提取试剂盒抽提bac质粒，用限制性内切酶切并进行脉冲场凝胶电泳鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：将鉴定正确的bac质粒在透析液(浓度为0.5ml的1mol/ltris-hcl,10ul的0.5mmol/l edta和1ml的5mol/l nacl用无菌水定容到50ml)中过夜透析纯化，将bac质粒溶液稀释到1-3ng/ul注射备用。

4.根据权利要求3所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，在第一日将4周龄nsg-mhc-dko雌鼠按每只5u腹腔注射pmsg，饲养47h后，按每只5u腹腔注射hcg并与种公鼠合笼过夜。

5.根据权利要求4所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：第四天输卵管膨大部收集受精卵进行显微注射，用注射针将稀释的bac质粒注射到胚胎的雄原核内，看到原核内部膨大为止，最后转移至m16培养液中培养。

6.根据权利要求1所述的一种人源化瘢痕疙瘩小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述步骤三中，取0.5d假孕icr受体鼠，麻醉，剔除背部毛发，酒精及碘酊消毒，剪开脊柱背侧皮肤，剪开脊柱两侧0....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽娟，祁少海，赵广银，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：