本发明专利技术涉及分离与纯化技术，具体是一种固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法。固定相结构如图，其中ＧＭＡＰｏｌｙｍｅｒ微球，粒径为１００ｎｍ－５０ｕｍ，ＧＭＡＰｏｌｙｍｅｒ微球为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球。通过氨基化和磷酸脂化，得到一种具有高效的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物磷酸酯基新型固定化金属亲和色谱固定相的合成方法，通过与锆离子和铁离子螯合，用于磷酸化蛋白质组学中的研究，可用于磷酸化肽段高选择性分离、富集与纯化，同时较传统固定相，降低了对非磷酸化肽段的非特异性吸附。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分离与纯化技术，具体是一种固定化金属的亲和色谱固定 相及其制备方法。
技术介绍
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化作 为一种最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，参与了几乎所有调 节生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉 收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号的主 要传递方式。蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记、化学修饰、Edman 降解以及薄层层析等方法。这些方法操作相对繁瑣，对实验技能要求较高， 蛋白样品需求量较大，或存在放射性污染等问题，限制了其广泛使用。近些年来用固定化金属亲和色谱来富集磷酸化肽段的方法由于其操作 简单，成本较低，对实验室要求也不那么严格，近些年得到了最为广泛的 应用。该方法的主要原理是利用磷酸化肽段所带的磷酸根与固定化金属亲 和色谱中所固载的金属离子之间发生作用，而非磷酸化肽不与之发生作用， 从而起到分离富集的效果。目前常用于磷酸化肽段富集的固定相多种多样， 主要有琼酯糖基、淀粉基、A1203、磁珠以及硅胶基质等，通过用亚胺二乙 酸等衍生，利用羧基再与金属离子如铁、镓等螯合，再用于磷酸化肽段富 集Aprilita, N. H. 等，"Poly(glycidyl methacrylate/divinylbenzene)-IDA-Fe-III in phosphoproteomics"，《Journal of Proteome Research》，P2312-2319 (2005年)；近 些年来Ti02和Zr02微球(Kweon, H. K等，"Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis", 《Analytical Chemistry》，1743-1749 (2006年))也应用于磷酸化肽段的富集，其本身即充当 基质，又提供与磷酸化肽段作用的金属离子。亦有文献报道利用磷酸酯中 的磷酸集团，与锆等金属离子相互作用，得到寡核苷酸单分子层，或利用 这种现象合成了以硅基质为基础的固定化金属亲和色谱基质，但以聚甲基 丙烯酸缩水甘油酯类聚合物磷酸酯为基质的固定化金属亲和色谱固定相用 于磷酸化肽段富集未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种通过化学反应将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物， 键合上磷酸酯基团，再与锆、铁等金属离子螯合，实现对磷酸化肽段的高 选择性分离、富集与纯化固定化金属的亲和色谱固定相及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为 固定相结构式为-.<formula>formula see original document page 5</formula>其中GMA Polymer微球，粒径为1 OOnm— 50um 。所述GMA Polymer微球为聚甲基丙烯酸縮水甘油酯类聚合物微球。所 述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯的交联 均聚物或甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚物微球。所述甲基丙烯 酸缩水甘油酯的交联均聚物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙烯基甲基丙烯 酸縮水甘油酯(GMA-EDMA);甲基丙烯酸缩水甘油酯与烯烃的交联共聚 物是指聚甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的的交联共聚物。固定相的制备方法包括以下步骤1) 氨基化反应将100-400 g/L的氨基化试剂溶液与GMAPolymer微 球以5-25ml/lg比例混合，在0-80。C下反应3-12h,反应后产物用水冲洗 至中性，得氨基化的微球；或将上述GMA Polymer微球采用上述GMA Polymer整体柱替换，泵入 流速为0.001-0.5 mL/min，即得氨基化的整体柱。2) 将步骤1 )得到每lg的氨基化的微球置于5-10 ml无水乙腈溶液中， 室温条件下反应过夜，待用；无水乙腈溶液中含有40-100mMPOC13, 40-60 mM2, 4, 6-三甲基卩比嚏;或将含有40-100 mM POC13, 40-60 mM 2, 4, 6-三甲基吡嚏的无水乙腈 溶液以0.001-0.5 mL/min的流速泵入步骤1)得到的氨基化的整体柱内,过 夜；3) 将50-100倍微球或整体柱体积的水加入到步骤2)得产物中，使其 充分水解；4) 将水解后的微球用醋酸或三氟乙酸将调至pH2-3，而后加入100 mM 的EDTA溶液(l g/5-10ml)，震荡l-2小时，离心，弃去上清液，沉淀用水 洗涤3-5次，真空干燥，即可到固定化金属亲和色谱固定相。或将pH 2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整体柱，流速为0.001-0.5 mL/min, 时间30-60 min,然后将1.00 mM的EDTA溶液泵入整体柱，流速为0.001-0.5 mL/min,时间30-60 min,再用水以0.001-0.5 mL/min的流速冲洗整体柱 30-60min,即可到固定化金属亲和色谱固定相。所述氨基化试剂为氨水、3，3-二氨丙基亚胺、乙二胺或1,6-二氨基已烷。固定相的预处理，使用前将所述固定化金属亲和色谱固定相与锆或铁离 子溶液以l:50-100(g/ml)的比例加入含有100-200 mM锆或铁离子的质量浓 度10%的醋酸溶液，放置过夜；离心，弃去溶液部份，再用质量浓度10% 的醋酸溶液洗涤3次，真空干燥；磷酸化肽段的分离、富集与纯化，具体操作使用所得的固定相时，将固定化金属亲和色谱固定相与蛋白样品以重量比为100-200: l混合，孵育30 分钟，洗涤去除非磷酸化肽段，最后用质量浓度为12.5%的氨水洗脱。 本专利技术所具有的优点本专利技术较传统固定化金属亲和色谱固定相可有效提高对磷酸化肽段的 选择性富集效果，且可以有效降低对非磷酸化肽段的非特异性吸附，基质 化学性质稳定，可在较广的pH范围内使用。本专利技术通过化学反应将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类聚合物，键合上磷 酸酯基团，再与锆、铁等金属离子螯合，实现对磷酸化肽段的高选择性分 离、富集与纯化。与传统的IMAC材料相比，其具有非特异性吸附小，分 辨率高等优点，聚合物微球可以方便的装填成各成IMAC柱，整体柱由于 体积可变，可以制成不同长度，不同内径的IMAC柱，特别是制成微柱后， 适合于微量样品中的磷酸化肽段的富集，并且可以方便地与^HPLC-ESI-MS 联用，提高质谱的检测限和灵敏度。附图说明图1为本专利技术的固定化金属亲和色谱固定相的合成路线示意图。图2为采用本专利技术的固定化锆离子亲和色谱固定相富集(x-酪蛋白中磷 酸化肽段的MALDITOF MS谱图。图3为釆用本专利技术的固定化锆离子亲和色谱固定相富集p-酪蛋白中磷 酸化肽段与标准磷酸化酪氨酸肽段混合的MALDITOF MS谱图。图4为采用本专利技术的固定化铁离子亲和色谱固定相富集a-酪蛋白中磷 酸化肽段的MALDITOFMS谱图。具体实施例方式下面结合附图说明对本专利技术作具体叙述。 实施例1固定相的制备方法包括以下步骤GMA Polymer微球的制备由聚甲基丙烯酸縮水甘油酯与乙烯基甲基 丙烯酸縮水甘油酯所得的微球，通过溶胀法，以聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化金属的亲和色谱固定相，其特征在于：固定相结构式为： ＊＊＊ 其中ＧＭＡ Ｐｏｌｙｍｅｒ微球，粒径为１００ｎｍ－５０ｕｍ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹汉法，封顺，叶明亮，周厚江，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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