【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测，更具体地说，涉及一种松材线虫病检测试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
1、被松材线虫感染后的松树，针叶失绿，变为黄褐色、红褐色，部分枝条枯死，直至全株萎蔫。国内外对该病研究多年，主要关注于对病原相关科学问题的探究，如病原种类、病原致病机理、病原线虫生态学特性、传播媒介、病害诊断及防治等。由于该病发生发展的复杂性，病原物的致病机理尚不十分清楚，目前仍缺少简便有效的防治手段。该病一旦发生，整个松林将遭受毁灭性破坏。因此，在松树未表现明显发病症状时，若能对感病松树进行早期的检测诊断，是当前松材线虫病防控中急需解决的几个关键技术难题之一。
2、研究前期利用松材线虫的特异性片段，并根据其片段设计特异性引物序列，开发了一套松材线虫自动化分子检测系统。通过钻取松树碎屑，经贝尔曼漏斗法分离松材线虫，提取线虫dna，将其上机检测，pcr扩增后判读检测结果以明确松树组织中是否存在松材线虫。该方法需在疑似感病松树中分离到松材线虫并提取线虫dna，而此时松树已相对处于感染的中期阶段，且仅分离松材线虫虫体这一步骤需至少3～6h时长。因此，若能在松树发病的更早阶段检测到松材线虫，同时缩短整体的检测时间，无疑可进一步掌握松材线虫病防控的窗口期。
3、效应子是由病原物在侵染早期分泌的一类外泌型蛋白，其可改变寄主植物细胞的结构和代谢途径，从而促进对寄主的成功侵染。本团队前期已陆续鉴定到多个在松材线虫侵染阶段，发挥关键作用的特异性效应蛋白。特异性效应蛋白在松材线虫中高度保守，与其他同源物种同源性较低，因此可以
4、双抗体夹心法基于特异性抗体与目标分子的高度亲和性，是一种检测抗原最常用的方法。将抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，再加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使一单位的抗原同时结合两单位的抗体形成“夹心”；最后加入该酶的底物，根据产生的有色产物颜色的深浅来判断待测抗原的含量。应用该原理制备的试纸条检测广泛应用于医学、环境和食品等领域。如验孕试纸则是利用双抗体夹心技术，以胶体金为指示标记，通过检测受孕妇女妊娠期产生的糖蛋白(hcg即人绒毛膜促性腺激素)，来确诊妇女是否怀孕。但该技术在林木病害的研究中鲜见报道。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种松材线虫病检测试纸条的制备方法。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种松材线虫病检测试纸条，用于早期快速检测松材线虫病。本专利技术还要解决的技术问题在于提供一种松材线虫病检测试纸条在早期快速检测松材线虫病中的应用。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种松材线虫病检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
4、半抗原的制备：将松材线虫效应蛋白通过水解法加入乙酸，制备得到半抗原；
5、免疫原和包被原的制备：将所述半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；
6、单克隆抗体的制备：用所述免疫原制备单克隆抗体，用所述包被原通过elisa检测单克隆抗体的灵敏度和特异性，得到松材线虫效应蛋白的单克隆抗体；
7、金标抗体的制备：将所述单克隆抗体用胶体金标记制备得到金标抗体；
8、胶体金试纸条的制备：用松材线虫效应蛋白的包被原在硝酸纤维素膜上制作检测线，以二抗在硝酸纤维素膜上制作质控线，然后组装成试纸条。
9、所述半抗原的制备具体步骤为：
10、将效应蛋白溶于乙酸和水中，加热回流，而后添加氢氧化钠水溶液，ph达到7.5，加纯水溶解沉淀物，用正己烷洗涤水溶液，分液酸化水层溶液，ph至6，然后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和的盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，减压蒸发，过硅胶柱，得到白色固体，即为半抗原。
11、所述免疫原和包被原的制备具体为：
12、免疫原的制备：将牛血清白蛋白bsa充分地溶解在碳酸盐缓冲液cbs中，得到bsa溶液，在磁力搅拌下将已活化的半抗原溶液逐滴地加到bsa溶液中，将混合物搅拌反应，得到免疫原；
13、包被原的制备：将鸡卵清白蛋白ova充分地溶解在碳酸盐缓冲液cbs中，得到ova质溶液，在磁力搅拌下将已活化的半抗原溶液逐滴地加到ova溶液中，将混合物搅拌反应，得到包被原。
14、所述金标抗体的制备具体为：取纯水加热沸腾，在搅拌条件下加入氯金酸溶液，再加入柠檬酸三钠溶液，得到胶体金溶液；该溶液加入硼酸缓冲液，充分混匀之后逐滴加入单克隆抗体溶液反应，分别研磨阳性枝条和阴性枝条样品，并将其分别用pbs缓冲液稀释，然后逐滴加入10％bsa封闭，得到混合溶液；将所述混合溶液离心，弃去上清液，得到沉淀物，将所述沉淀物溶于重悬液中，得到金标抗体。
15、取纯水加热沸腾，在搅拌条件下加入氯金酸溶液，再加入柠檬酸三钠溶液，得到胶体金溶液；该溶液加入硼酸缓冲液，充分混匀之后逐滴加入单克隆抗体溶液反应，分别研磨阳性枝条和阴性枝条样品，并将其分别用pbs缓冲液稀释，然后逐滴加入10％bsa封闭，得到混合溶液；将所述混合溶液离心，弃去上清液，得到沉淀物，将所述沉淀物溶于重悬液中，得到金标抗体。
16、所述胶体金试纸条的制备具体为：
17、将样品垫放进含tween-20、蔗糖和bsa的pbs溶液中浸泡后烘干；将包被原喷涂在硝酸纤维素膜上作为检测线，将二抗喷涂在硝酸纤维素膜上作为质控线；将所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板进行组装即为成品试纸条。
18、任一所述的制备方法制备得到的松材线虫病检测试纸条。
19、所述的试纸条在检测松材线虫病中的应用。
20、所述的应用，步骤如下：
21、1)将待检测松树茎段组织研磨后，用裂解液稀释10倍，取1ml稀释后的液体滴加在试纸条的待测孔中；将试纸条于常温下，静置10min，观察膜上的质控线和检测线的显色情况，判断结果；
22、2)质控线未显色，更换试纸条，重新检测直至质控线显色；质控线和检测线均显色，待测样品检测结果为阳性；质控线显色，检测线未显色，对样品溶液进行浓缩10倍或重新制备浓缩样品，再次进行检测，仍为质控线显色，检测线未显色，判定为阴性。
23、相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
24、1)本专利技术研发创制了松材线虫特异性效应蛋白bx-far-1的试纸条，使用的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，有利于避免检测过程中的假阳性情况。
25、2)本专利技术通过采用胶体金标记单克隆抗体制备的试纸条缩短了松材线虫病的检测时间，优化了整体的检测流程，为进一步推进松材线虫病的早期检测提供了技术支撑。
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1.一种松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述半抗原的制备具体步骤为：
3.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫原和包被原的制备具体为：
4.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述金标抗体的制备具体为：
5.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述胶体金试纸条的制备具体为：
6.权利要求1-5任一所述松材线虫病检测试纸条的制备方法制备得到的松材线虫病检测试纸条。
7.权利要求6所述松材线虫病检测试纸条的试纸条在检测松材线虫病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下：
【技术特征摘要】
1.一种松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述半抗原的制备具体步骤为：
3.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫原和包被原的制备具体为：
4.根据权利要求1所述松材线虫病检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述金标抗体...
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