【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微量蛋白免疫学定性检测领域，特别是涉及一种用于b型肉毒神经毒素的检测方法及应用。
技术介绍
1、肉毒毒素是由肉毒梭状芽胞杆菌生长、繁殖过程中产生的细菌外毒素，根据抗原性分为7个型，即a、b、c、d、e、f、g。肉毒毒素具有强烈毒性，肉毒毒素污染的食品可致食物中毒，严重者可致命，造成人类肉毒中毒的型别主要有a、b、e、f型，因此肉毒毒素检验是食品卫生检验的重要内容，进行肉毒毒素的防治研究对国家生物安全、社会卫生安全都具有重要意义。免疫学检测是肉毒毒素检测的主要方法。
2、临床上肉毒中毒抢救的关键是及早做出正确诊断，这关系到能否挽救生命，对症状的诊断仅为参考，决定性的诊断是中毒食物的定性检测，对中毒食物的定性检测是诊断的关键，对中毒食物中毒素的型别鉴定是做出治疗方案的关键。在毒素的实验室研究领域除需对样品的定性检测和鉴别检测外还需纯度、稳定性等方面检测。
3、现有的常规技术首先为免疫中和毒素基础上的实验动物法，该方法的缺陷是：1)检测时间长，通常2-4天；2)使用实验动物，在实验伦理方面面临压力，势必淘汰；3)动物存在个体差异导致实验误差较大；4)型别鉴定使用的是诊断血清，灵敏度较低，结果以小鼠死亡情况和症状判断，需在2-4天内对小鼠持续观察，如不能持续观察则可能错过小鼠症状观察，亦存在小鼠因其它原因死亡(非特异性死亡)，因此对于毒素的鉴别效果不佳。第二种常用检测技术是elisa夹心法，但elisa方法缺陷在于：灵敏度仅能达到ng级，对于pg级的毒素无法检出，而肉毒毒素因毒性极强，极微量毒素即可
4、虽然还存在肉毒毒素的其它分析方法，但仅用于毒素的结构分析等理论性较强的领域，并不是临床和实验室检测的常规方法。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术开发了一种基于夹心法的毛细管免疫电泳检测技术，该方法能够达到pg级灵敏度。具体地，本专利技术包括以下内容。
2、本专利技术的第一方面，提供一种用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其包括在毛细管中以捕获抗体、待测样本和检测抗体形成夹心复合物并催化检测液产生能够被检测器捕捉的信号，从而确定b型肉毒神经毒素的存在和/或进行b型肉毒神经毒素的定量，其中，所述捕获抗体能够靶向b型肉毒神经毒素，所述捕获抗体包含氨基酸序列分别如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重链cdr1-3，和/或氨基酸序列分别如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的轻链cdr1-3。
3、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
4、(1)将捕获抗体、待测样本、检测抗体和检测液分别加入毛细管免疫电泳装置的检测板中；
5、(2)使所述待测样本与捕获抗体在毛细管组件内结合后进一步与所述检测抗体结合形成复合物，并以不同的区带通过毛细管；
6、(3)使所述检测抗体催化检测液，根据荧光信号确定b型肉毒神经毒素的存在和/或定量。
7、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其中，所述检测抗体具有(i)-(iii)所示的任意一种氨基酸序列：
8、(i)包含seq id no.1所示的重链氨基酸序列和/或seq id no.2所示的轻链氨基酸序列；
9、(ii)与(i)所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，且具有相同功能的氨基酸序列；
10、(iii)与(i)或(ii)所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的且具有相同功能的氨基酸序列。
11、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其中，所述检测抗体为酶标抗体，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
12、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其中，所述检测液包括化学发光剂或显色剂，所述辣根过氧化物酶对应的检测液包括鲁米诺、邻苯二胺、四甲基联苯胺、5-氨基水杨酸和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐中的至少一种，所述碱性磷酸酶对应的检测液包括amppd、吖啶酯和4-甲基伞形酮磷酸酯中的至少一种，所述β-半乳糖苷酶对应的检测液包括5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷、对-硝基苯磷酸脂和4-甲基伞酮基-r-d半乳糖苷中的至少一种。
13、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其中，所述捕获抗体和所述检测抗体的浓度为0.1-50mg/ml。
14、本专利技术的第二方面，提供一种用于b型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其包括：
15、i.捕获抗体溶液，其中，所述捕获抗体能够靶向b型肉毒神经毒素，所述捕获抗体包含氨基酸序列分别如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重链cdr1-3，和/或氨基酸序列分别如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的轻链cdr1-3；
16、ii.检测抗体溶液；
17、iii.检测液。
18、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其中，所述检测液为等体积的鲁米诺和过氧化氢的混合溶液。
19、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的用于b型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒进一步包括5×master mix、sample buffer。
20、本专利技术的第三方面，提供根据本专利技术所述的方法，或所述的试剂盒的应用，其中，所述应用包括b型肉毒神经毒素生产或b型肉毒神经毒素标准品的质量控制、监测。
21、本专利技术的方法检测时间短，可在6h检出结果，同时作为定性检测法灵敏度高，达到皮克级，比其他方法高出1-2个数量级，对于微量毒素样品检测优势明显。相对于使用抗血清检测的动物法，采用单克隆抗体对检测特异性高，不论是用于科研检测和食品卫生检验均有利于准确决策，且相对于动物法误差小。此外，本专利技术产生的肉毒神经毒素双抗体夹心反应特征峰可用于肉毒毒素和肉毒神经毒素的稳定性检测，对于肉毒毒素产品生产、质量控制、新品研发、检定用标准品的质控和监测及市场监督起到其它方法无法替代的作用。因此，本专利技术可用于指导建立毒素免疫检测标准物质，推动毛细管免疫检测技术成为新的肉毒毒素检测标准方法。
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1.一种用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，包括在毛细管中以捕获抗体、待测样本和检测抗体形成夹心复合物并催化检测液产生能够被检测器捕捉的信号，从而确定B型肉毒神经毒素的存在和/或进行B型肉毒神经毒素的定量，其中，所述捕获抗体能够靶向B型肉毒神经毒素，所述捕获抗体包含氨基酸序列分别如GFAFSSYD、ISSGGSST和ARQAFYTYDGTAMDY所示的重链CDR1-3，和/或氨基酸序列分别如QSIVHNNGDTY、KVS和FQGSHIPWT所示的轻链CDR1-3。
2.根据权利要求1所述的用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测抗体具有(I)-(III)所示的任意一种氨基酸序列：
4.根据权利要求1所述的用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测抗体为酶标抗体，用于标记的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
5.根据权利要求4所述的用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测液包括化学发光剂
6.根据权利要求1所述的用于B型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体和所述检测抗体的浓度为0.1-50mg/mL。
7.一种用于B型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的用于B型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其特征在于，所述检测液为鲁米诺和过氧化氢的混合溶液。
9.根据权利要求7所述的用于B型肉毒神经毒素的毛细管免疫电泳检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒进一步包括Master Mix和Sample Buffer。
10.根据权利要求1-6任一项所述的方法，或根据权利要求7-9任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用包括B型肉毒神经毒素生产或B型肉毒神经毒素标准品的质量控制、监测。
...【技术特征摘要】
1.一种用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，包括在毛细管中以捕获抗体、待测样本和检测抗体形成夹心复合物并催化检测液产生能够被检测器捕捉的信号，从而确定b型肉毒神经毒素的存在和/或进行b型肉毒神经毒素的定量，其中，所述捕获抗体能够靶向b型肉毒神经毒素，所述捕获抗体包含氨基酸序列分别如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重链cdr1-3，和/或氨基酸序列分别如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的轻链cdr1-3。
2.根据权利要求1所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测抗体具有(i)-(iii)所示的任意一种氨基酸序列：
4.根据权利要求1所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测抗体为酶标抗体，用于标记的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。
5.根据权利要求4所述的用于b型肉毒神经毒素的检测方法，其特征在于，所述检测液包括化学发光剂或显色剂，所述辣根过氧化物酶对应的检测液包括鲁米诺、邻苯二...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆俭，周易，王怡之，张若晖，马亚峰，张政，朱俐，
申请(专利权)人：兰州生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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