【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物发酵，具体地，涉及一种发酵生产l-组氨酸的方法。
技术介绍
1、组氨酸（l-histidine）化学名α-氨基β-咪唑基丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸。l-组氨酸是人体的一种半必需氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料行业,还用于烟草制品和化妆品的生产中。l-组氨酸的生产以蛋白质水解法为主,但此法存在操作步骤繁琐、环境污染大、生产成本高等问题。近年来，微生物发酵法已成功应用于多种氨基酸的工业生产中,具有发酵周期短、成本低、作用条件温和、过程易控制和产率高等优点,也是工业化生产l-组氨酸的首选方法。采用微生物发酵法生产l-组氨酸具有广阔的前景，而且其产率还有很大的提高空间。
2、现有技术对组氨酸生物发酵研究主要包括：筛选菌株、优化培养工艺以及添加刺激因子等因素。
3、文献1：生物技术2008年，赵建云等，发现在发酵培养基中添加葡萄糖酸钙能够增加hmp途径的通量，有利于谷氨酸棒杆菌clw0911中组氨酸的合成。
4、文献2：微生物技术通讯2009年，朱文泽等，提供了一种提高l-组氨酸发酵过程产率的方法，根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高谷氨酸棒杆菌tl1105中l-组氨酸发酵的产率。
5、文献3：cn112481325a，不同菌株的产酸机制以及对刺激因子的耐受程度差异较大，但是并不具备借鉴意义，尽管现有技术对谷氨酸的产酸机制作了较多研究，例如在发酵培养基中添加适量的苹果酸钠能够提高谷氨酸棒杆菌产组氨酸的量，但是苹果酸钠对粘
6、原核生物细胞能量和物质代谢的途径是一个很复杂的网络, 改变代谢途径中的基因会对能量和物质流产生怎样的影响, 仍然不是很清楚。由于不同的菌株的代谢通路也存在较大差异，针对不同的发酵菌株，需要通过实验手段进行测试，如何提高特定菌株的发酵性能是需要解决的技术问题。
7、针对上述问题，申请人之前的专利技术“cn2024111171676”提供了一种利用生物发酵生产l-组氨酸的工艺，通过调节代谢网络来调控l-组氨酸的合成。本专利技术在上述研究的基础上，继续对发酵液进行分离提取，并优化其工艺。
技术实现思路
1、在已有研究的基础上，本专利技术提供了一种发酵生产l-组氨酸的方法，该工艺发酵效率高，分离纯化工艺简单可行，制备的产品收率和纯度均有所提高。
2、包括组氨酸、色氨酸、缬氨酸以及苯丙氨酸在内的芳香族或杂环族氨基酸均与hmp途径相关，途径中的赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族、杂环族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸）的关键原料。大肠埃希氏菌（escherichia coli）tr2023d-1的产色氨酸能力较出发菌株大幅增加，说明hmp途径的代谢流增加，与hmp途径相关的其他氨基酸（包括组氨酸）的合成能力也极有可能上调，而该菌株属于苯丙氨酸、酪氨酸缺陷型菌株，无需对苯丙氨酸和酪氨酸的合成进行调控。
3、基于上述理论，研究和优化产色氨酸的大肠埃希氏菌（escherichia coli）tr2023d-1的产组氨酸性能，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.27549（cn117778225a，已保藏）。
4、本专利技术是通过如下技术方案来实现的。
5、一种发酵生产l-组氨酸的方法，其包括如下步骤：
6、步骤1）制备一级种子液，步骤2）制备二级种子液，步骤3）发酵，步骤4）离心、过滤，步骤5）脱色，步骤6）结晶。
7、具体地，所述方法包括如下步骤：
8、步骤1）制备一级种子液：将产l-组氨酸的大肠埃希氏菌进行活化，接种到lb液体培养基，37℃振荡培养36h，得到一级种子液；
9、步骤2）制备二级种子液：将一级种子液按照15%的接种量接入到二级种子培养基中，37℃振荡培养至od600值为8左右，得到二级种子液；
10、步骤3）发酵：将二级种子液按照8%的接种量接入含有发酵培养基的自动控制发酵罐中，培养温度36℃，通过流加葡萄糖溶液的维持还原糖含量为5g/l，发酵结束前4h停止流加葡萄糖溶液；通过流加25%氨水维持发酵罐内ph在7.0，流加消泡剂消泡；发酵总时间为48h，即得l-组氨酸发酵液；
11、步骤4）离心、过滤：l-组氨酸发酵液进入碟片离心机离心，收集上层液体，然后通过陶瓷膜进行过滤，去除大分子蛋白质，收集滤过液，然后经过超滤膜进行超滤，收集超滤液；
12、步骤5）脱色：往超滤液中按照1g：100ml的比例添加活性炭，温度控制在75℃，搅拌脱色时间60min，然后再静置30min，板框过滤去除活性炭，收集过滤液；
13、步骤6）结晶：将滤过液中添加氢氧化钠，调节ph为7.6，然后以10℃/h的降温速度进行降温，100rpm搅拌降温结晶，待温度降低至5℃时，停止搅拌，静置析晶2h，然后离心分离湿晶体，70℃真空烘干，即得l-组氨酸产品。
14、优选地，所述二级种子培养基组分为：蔗糖30g/l、磷酸二氢钾5g/l、磷酸氢二钾5g/l、酵母膏5g/l、七水硫酸镁1g/l、七水硫酸亚铁50mg/l、生物素0.1mg/l；ph控制在7.0。
15、优选地，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.4g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸10mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。
16、优选地，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖500g/l+一磷酸腺苷15g/l。
17、优选地，所述陶瓷膜的截留分子量为10000da。
18、优选地，所述超滤膜的截留分子量为500da。
19、优选地，所述碟片离心机以5000rpm离心3min。
20、本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
21、代谢网络是一个十分复杂的多酶同步催化反应体系，仅仅改变其中的一步限速反应，对产物合成的影响往往可能不会很大，因此要优化某一代谢网络，必须同时调节对产物有影响的主要节点，使代谢流量重新获得分配，以利于目的产物的积累。本专利技术通过对发酵培养基以及刺激因子等条件的优化，将产色氨酸的大肠埃希氏菌tr2023d-1的产组氨酸性能大幅提升，相应地弱化了hmp途径中色氨酸的合成效率。苹果酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，减少丙酮酸的积累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累，磷酸烯醇式丙酮酸是emp途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制剂，所以磷酸烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性，从而降低了emp途径的通量，缓解了emp和tca之间的代谢溢流。同时，葡萄糖总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入hmp合成途径，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种发酵生产L-组氨酸的方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二级种子培养基组分为：蔗糖30g/L、磷酸二氢钾5g/L、磷酸氢二钾5g/L、酵母膏5g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁50mg/L、生物素0.1mg/L；pH控制在7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵8g/L、磷酸二氢钾5g/L、柠檬酸2g/L、七水硫酸镁1.5g/L、苹果酸钠0.4g/L、七水硫酸亚铁100mg/L、吲哚丙酸10mg/L、硫胺素0.5mg/L、生物素0.2mg/L；pH控制在7.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖500g/L+一磷酸腺苷15g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为10000Da。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为50
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碟片离心机以5000rpm离心3min。
9.按照权利要求1-8所述的方法获得的L-组氨酸产品。
10.权利要求9所述的L-组氨酸产品在制备药品中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种发酵生产l-组氨酸的方法，其包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二级种子培养基组分为：蔗糖30g/l、磷酸二氢钾5g/l、磷酸氢二钾5g/l、酵母膏5g/l、七水硫酸镁1g/l、七水硫酸亚铁50mg/l、生物素0.1mg/l；ph控制在7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.4g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸10...
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，冯世红，李学朋，李建华，王奎智，李树标，崔小红，
申请(专利权)人：新疆阜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。