一种基于RT-LAMP-Cas14a无PAM限制的水产神经坏死病毒检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于RT‑LAMP‑Cas14a无PAM限制的石斑鱼神经坏死病毒检测方法，所述方法是一种基于一组特异性的神经坏死病毒RNA RT‑LAMP扩增引物，在FIP引物的3’端引入PAM序列，经过60℃恒温扩增后其产物被CRISPR‑Cas14a特异性识别，随后激活Cas14a酶并触发其非特异性反式切割能力的一种方法。具体涉及水产病毒快速诊断领域。由于神经坏死病毒RNA核酸序列不含Cas14a识别的PAM序列，本发明专利技术对RT‑LAMP扩增引物进行改造，实现RNA核酸一步法扩增与CRISPR‑Cas14a相结合，使其突破了Cas14a检测技术的限制，为神经坏死病毒提供一种高特异性、高灵敏度的检测技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于重要水产病毒检测领域，具体涉及一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法。

技术介绍

0、技术背景

1、神经坏死病毒(nnv)属于nodaviridae科betanodavirus属，主要存在于受感染鱼类的脑细胞和视网膜细胞的细胞质中。它是一个无包膜的十二面体，直径约为25-34nm，含有两条单链rna分子，即rna 1(3.1kb)和rna2(1.4kb)。nnv可感染40多种鱼类，包括鲈形目、褶形目和鳕形目等。nnv对感染鱼类的致死率极高，主要表现为厌食、活力下降、常侧卧在水下不游动、下颌和尾鳍红肿溃烂，发病后鱼口大张。目前，nnv的防御和控制方法主要有两种：1)通过物理或化学方法进行消毒和灭活；2)使用疫苗(如灭活疫苗、蛋白疫苗和dna疫苗)进行预防和控制。遗憾的是，目前还没有有效的鱼类nnv治疗方法。因此，必须开发一种敏感而特异的诊断方法，以便及时有效地控制nnv的传播。

2、目前已报道的nnv检测方法多种多样，包括传统的细胞培养和电子显微镜、基于抗体的荧光免疫技术以及基于核酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于RT-LAMP-Cas14a无PAM限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，设计的RT-LAMP引物组可在等温扩增后引入PAM序列，含PAM位点的扩增产物可被Cas14a和sgRNA复合物特异性识别，并激活Cas14的反式切割活性，非特性切割ssDNA报告探针进而得到可视化检测信号。

2.权利要1所述的一种基于RT-LAMP-Cas14a无PAM限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于：包括一对内引物FIP-PAM和BIP，一对外引物F3和B3，一对环状引物LF和LB，所述内引物序列为：

3.权利要1所述的一种基于RT-LAMP-Cas14a无P...

【技术特征摘要】

1.一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于，设计的rt-lamp引物组可在等温扩增后引入pam序列，含pam位点的扩增产物可被cas14a和sgrna复合物特异性识别，并激活cas14的反式切割活性，非特性切割ssdna报告探针进而得到可视化检测信号。

2.权利要1所述的一种基于rt-lamp-cas14a无pam限制的水产神经坏死病毒检测方法，其特征在于：包括一对内引物fip-pam和bip，一对外引物f3和b3，一对环状引物lf和lb，所述内引物序列为...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋凤阁，阳秀芬，邵宝凯，鲁琳，万逸，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：