【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子检测，特别是涉及基于m6a甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法。
技术介绍
1、mrna的n6-甲基腺苷(m6a)修饰发生在mrna的腺苷n6位点，是在哺乳动物中调节基因表达的转录后修饰过程。m6a的调控是通过甲基转移酶复合物、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白之间构成的动态可逆调控网络来实现的。甲基转移酶的主要作用是催化mrna上腺苷酸的m6a修饰，主要由甲基转移酶样3/14、锌指ccch型含13和wilms肿瘤1关联蛋白(wtap)等蛋白组成。去甲基化酶将m6a修饰的碱基去甲基化，主要由脂肪量和肥胖相关蛋白(fto)和alkb同源物5(alkhb5)等蛋白组成。阅读蛋白的主要功能是识别m6a修饰发生的碱基，从而激活下游调控通路。阅读蛋白主要由yth结构域家族成员yth结构域家族1/2/3(ythdf1/2/3)、含yth结构域1/2(ythdc1/2)、胰岛素样生长因子2mrna结合蛋白(igf2bps)和几种异质核核糖核蛋白(hnrnps)组成。越来越多的研究表明了m6a对家禽成肌细胞增殖的影响。然而，没有与鹌鹑胚胎的腿肌成肌细胞增殖分化相关的报道。
2、本专利技术在前期研究的基础上对鹌鹑胚胎期第8天和第14天这两个时期的腿肌采用merip-seq组学分析，寻找受m6a调控相关差异基因。发现m6a修饰普遍存在于鹌鹑胚胎期腿肌发育中，且在腿肌分化的不同胚龄中存在明显的差异表达，m6a修饰在鹌鹑腿肌细胞增殖分化中起关键作用，对鹌鹑的后续培育的指导提供数据支持。
技
1、本专利技术的目的是提供基于m6a甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术发现m6a修饰普遍存在于鹌鹑胚胎期腿肌发育中，且在腿肌分化的不同胚龄中存在明显的差异表达，m6a修饰在鹌鹑腿肌细胞增殖分化中起关键作用，本专利技术可为鹌鹑培育提供数据支持与技术支撑。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供基于m6a甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法，包括以下步骤：
4、取胚胎期第8天和第14天的鹌鹑胚胎腿肌，提取总rna得rna样品；
5、将rna样品分为两份，一份利用m6a特异性抗体富集，另一份不做处理作为对照，对两份rna分别构建链特异性文库；
6、分别对文库进行测序、比对分析和峰扫描，获得m6a峰；
7、对m6a峰进行富集分析获得差异甲基化rna。
8、进一步地，在将rna样品分为两份前，还包括对rna样品进行质量检测的步骤。
9、进一步地，当rna样品当rna样品峰图基线平整、rin＞7且28s rrna的峰高与18srrna的峰高之比为1：2时，为质量检测合格。
10、进一步地，还包括对差异甲基化rna进行go和kegg富集分析，鉴定差异甲基化rna的步骤。
11、进一步地，所述go富集分析差异甲基化rna得到的生物学过程包括细胞过程、单生物过程和代谢过程。
12、进一步地，所述kegg富集分析差异甲基化rna得到的信号通路包括钙离子信号通路和心肌细胞中的肾上腺素能信号通路。
13、进一步地，参与鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的m6a甲基化高表达基因为cacna1c、flt1、flt4、erbb2和igf1r。
14、本专利技术还提供所述的方法在鉴别调节鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化的差异甲基化rna中的应用。
15、本专利技术还提供所述的方法在调控鹌鹑腿肌发育中的应用。
16、本专利技术公开了以下技术效果：
17、本专利技术公开了基于m6a甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法。选择鹌鹑胚胎第8天(e8)和第14天(e14)的腿肌，进行merip-seq转录分析。对鹌鹑腿肌成肌细胞的m6a修饰进行鉴定发现e8存在28919个m6a峰，e14有22839个m6a峰。差异表达m6a峰主要富集在与物质和能量代谢相关的条目上，kegg富集分析显示鹌鹑腿肌增殖分化与钙离子信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路密切相关。
18、并且，本申请经构建蛋白网络互作图发现，m6a甲基化显著差异高表达基因包括cacna1c、flt1、flt4、erbb2、igf1r，这些基因分别与钙离子通道，血管内皮生长因子受体编码，蛋白编码，参与细胞生长和控制以及细胞增殖、分化、成熟和凋亡机制相关，由此可见m6a甲基化与肌肉细胞生长发育息息相关。
19、综上所述，本专利技术发现m6a修饰普遍存在于鹌鹑胚胎期腿肌发育中，且在腿肌分化的不同胚龄中存在明显的差异表达，m6a修饰在鹌鹑腿肌细胞增殖分化中起关键作用，本专利技术可为鹌鹑培育提供数据支持与技术支撑。
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1.基于m6A甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在将RNA样品分为两份前，还包括对RNA样品进行质量检测的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当RNA样品峰图基线平整、RIN＞7且28srRNA的峰高与18s rRNA的峰高之比为1：2时，为质量检测合格。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对差异甲基化RNA进行GO富集分析和KEGG富集分析，鉴定差异甲基化RNA的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述GO富集分析差异甲基化RNA得到的生物学过程包括细胞过程、单生物过程和代谢过程。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KEGG富集分析差异甲基化RNA得到的信号通路包括钙离子信号通路和心肌细胞中的肾上腺素能信号通路。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，参与鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的m6A甲基化高表达基因为CACNA1C、FLT1、FLT4、ERBB2和IGF1R。<...
【技术特征摘要】
1.基于m6a甲基化测定鹌鹑胚胎腿肌成肌细胞增殖和分化调节的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在将rna样品分为两份前，还包括对rna样品进行质量检测的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当rna样品峰图基线平整、rin＞7且28srrna的峰高与18s rrna的峰高之比为1：2时，为质量检测合格。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对差异甲基化rna进行go富集分析和kegg富集分析，鉴定差异甲基化rna的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述go富集分析差异...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈彪，周亚南，蒋红霞，刘三凤，毛辉荣，胡晓龙，许继国，吴金涛，张文韬，刘水兵，蒋东成，刘璟，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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