【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种工程化毕赤酵母发酵的血红蛋白及其制备方法。
技术介绍
1、由于全球人口的繁荣和消费者对健康和环境保护的日益认识，对肉类替代品的需求正在上升。人造肉作为一种高蛋白、低脂、环保的替代品，正逐渐受到消费者的欢迎。此外，人造肉技术的发展可以解决传统农业和畜牧业中出现的激素的问题，抗生素，农药残留和人畜共患病毒、寄生虫和致病菌感染，并且也可以节省75％的水，87％的温室气体排放，和所需的95％的土地面积。然而，目前人造肉与真肉的味道、质地、颜色和味道仍有显著差异，需要通过外源添加血红蛋白赋色。此外，外源添加血红蛋白还可为植物肉产品提供铁离子，满足特定营养的需求。
2、血红蛋白(hemoglobin,hb)存在于原核细胞和真核细胞中，由血红素辅助因子和珠蛋白组成。根据其来源和结构，血红蛋白主要可分为动物血红蛋白、微生物血红蛋白和植物血红蛋白。由于其潜在的药物和营养价值，它们被应用于不同的领域。例如，来自crocodylus siamensis的血红蛋白具有作为抗炎剂的潜力。来自vitreoscilla的血红蛋白具有明显较快的氧解离速率，经常被用于增强呼吸和能量代谢。据我们所知，在植物衍生的血红蛋白中，大豆血红蛋白可以大大提高植物肉制品的味道和风味，在美国、澳大利亚、新西兰、新加坡等国，被批准为商业用途的新型合成食品原料。
3、血红蛋白珠蛋白的合成与一般蛋白质的合成一致，但其中所含血红素的合成由几个反应组成：(1)ala的生成：在线粒体内，甘氨酸(glycine)和琥珀酰coa(succ
4、(uroporphyrinogen iii，upg iii)及粪卟啉原ⅲ(coproporphyrinogen iii,cpgiii)的生成：在胞浆四分子pbg在卟胆原脱氨酶(porphobilinogen deaminase,pbgd,编码基因为hem3)和尿卟啉原ⅲ合酶(uroporphyrinogen iii synthase,uros,编码基因为hem4)协同催化下，脱氨缩合成upg iii，再经尿卟啉原脱羧酶(uroporphyrinogen iiidecarboxylase,urod,编码基因为hem12)作用生成粪卟啉原ⅲcpg iii；(4)血红素的生成：cpg iii经扩散重新进入线粒体。在粪卟啉原氧化脱羧酶(coproporphyrinogen iiioxidase,cpo,编码基因为hem13)催化下，生成原卟啉原ⅸ(protoporphyrinogen ix，ppgix)，再经原卟啉氧化酶(protoporphyrinogen ix oxidase,ppo,编码基因为hem14)作用，生成原卟啉ⅸ(protoporphyrin ix，ppoix)。后者和fe在血红素合成酶(ferrochelatase，fech,编码基因为编码基因为hem15)催化下，生成血红素(heme)。血红素由线粒体转入胞浆与珠蛋白结合成血红蛋白。
5、为挖掘和高效生物合成植物血红蛋白用于满足植物肉赋色同时增加营养的需求，本领域的技术人员致力于开发一种血红素结合率高的新型血红蛋白及其制备方法。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是开发一种血红素结合率高的新型血红蛋白及其制备方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了来源于红豆的新型血红蛋白，血红蛋白的珠蛋白核苷酸序列如seq id no：1所示，血红蛋白的珠蛋白氨基酸序列如seq id no：2所示。
3、进一步地，红豆为vigna angularis。
4、本专利技术还提供了新型血红蛋白的生物合成方法，包括以下步骤：
5、步骤1、将编码vahb珠蛋白的基因插入gs115毕赤酵母基因组的aox1位点，构建血红蛋白vahb珠蛋白的合成途径；编码vahb珠蛋白的基因核苷酸序列如seq id no：1所示；
6、步骤2、在gs115毕赤酵母4号染色体上继续引入血红蛋白vahb珠蛋白表达盒，得到高拷贝珠蛋白表达工程菌株；
7、步骤3、将编码血红素合成途径的关键酶基因hem1，hem2，hem3，hem4，hem12，hem13，hem14，hem15整合到步骤2得到的高拷贝珠蛋白表达工程菌株基因组，得到菌株；关键酶基因hem1的核苷酸序列如seq id no：3所示，关键酶基因hem2的核苷酸序列如seq idno：4所示，关键酶基因hem3的核苷酸序列如seq id no：5所示，关键酶基因hem4的核苷酸序列如seq id no：6所示；
8、步骤4、利用步骤3构建的菌株诱导发酵制备得到血红蛋白珠蛋白及血红素。
9、进一步地，步骤1还包括：在基因组aox1位点利用ptva手段增加拷贝数。
10、进一步地，步骤2中血红蛋白vahb珠蛋白表达盒为tef1p-vahb-aox1t和aox1p-vahb-aox1t两个表达盒；tef1p-vahb-aox1t表达盒中tef1为启动子，aox1为终止子；aox1p-vahb-aox1t表达盒中aox1为启动子，aox1为终止子。aox1启动子的核苷酸序列如seq idno：23所示，aox1终止子序列的核苷酸序列如seq id no：24所示，tef1启动子序列的核苷酸序列如seq id no：25所示。
11、进一步地，步骤3还包括：包含关键酶基因hem1，hem2，hem3，hem4，hem12，hem13，hem14，hem15的表达盒的线性化片段获取方法为pcr，其通用引物为：
12、上游引物：5’-ctcaaacagaaaggccatgg-3’
13、下游引物：5’-gtacccggggatcctctaga-3’
14、进一步地，该方法包括以下步骤：
15、步骤1)、将hem-all工程菌株活化后，挑取单菌落接入液体培养基制备一级种子，od达到1-2之间，转接到装有液体培养基的二级种子瓶中，od在1-2，接种入1l发酵罐；hem-all工程菌株基因型为hem3-1-2-12-4-15::tef1p-hem14-aox1t-aox1p-hem13-aox1t,fragb-0067；hem-all工程菌株为通过crispr/cas9基因编辑手段将血红素合成途径关键酶基因的表达盒整合进菌株vahb-h7-ptef1-paox1得到；
16、步骤2)、培养基成分为ypdf培养基，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种来源于红豆的新型血红蛋白，其特征在于，所述血红蛋白中珠蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述珠蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的新型血红蛋白，其特征在于，所述红豆为Vigna angularis。
3.如权利要求1所述的新型血红蛋白的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤1还包括：在基因组AOX1位点利用PTVA手段增加拷贝数。
5.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤2中所述血红蛋白珠蛋白VaHB表达盒为TEF1p-VaHB-AOX1t和AOX1p-VaHB-AOX1t两个表达盒；所述TEF1p-VaHB-AOX1t表达盒中TEF1为启动子，AOX1为终止子；所述AOX1p-VaHB-AOX1t表达盒中AOX1为启动子，AOX1为终止子；所述AOX1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述AOX1终止子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示，所述TEF1启动子序列的核苷酸
6.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤3还包括：包含所述关键酶基因HEM1，HEM2，HEM3，HEM4，HEM12，HEM13，HEM14，HEM15的表达盒的线性化片段获取方法为PCR，其通用引物为：
7.如权利要求1所述的新型血红蛋白的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
8.如权利要求7所述的新型血红蛋白的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述血红素合成途径关键酶基因的表达盒AOX1p-HEM1-AOX1t通过CRISPR/Cas9基因编辑手段整合进菌株VaHB-H7和VaHB-H7-pTEF1-pAOX1得到所述工程菌株VaHB-H7-H1，HEM1；将血红素合成途径关键酶基因的表达盒AOX1p-HEM1-AOX1t和TEF1p-HEM3-CYC1t，AOX1p-HEM12-AOX1t和TEF1p-HEM2-CYC1t，AOX1p-HEM15-AOX1t和TEF1p-HEM4-CYC1t,AOX1p-HEM13-AOX1t和TEF1p-HEM14-CYC1t分别通过CRISPR/Cas9基因编辑手段相继整合进菌株VaHB-H7-pTEF1-pAOX1，得到了菌株HEM3-1，HEM3-1-2-12，HEM3-1-2-12-4-15和HEM-ALL；其中所述TEF1p-HEM3-CYC1t，TEF1p-HEM2-CYC1t，TEF1p-HEM4-CYC1t,和TEF1p-HEM14-CYC1tCYC1表达盒的终止子为CYC1，所述CYC1的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示。
9.如权利要求1所述的新型血红蛋白作为食品着色剂的应用。
10.如权利要求1所述的新型血红蛋白作为食品风味剂的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种来源于红豆的新型血红蛋白，其特征在于，所述血红蛋白中珠蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述珠蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
2.如权利要求1所述的新型血红蛋白，其特征在于，所述红豆为vigna angularis。
3.如权利要求1所述的新型血红蛋白的生物合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤1还包括：在基因组aox1位点利用ptva手段增加拷贝数。
5.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤2中所述血红蛋白珠蛋白vahb表达盒为tef1p-vahb-aox1t和aox1p-vahb-aox1t两个表达盒；所述tef1p-vahb-aox1t表达盒中tef1为启动子，aox1为终止子；所述aox1p-vahb-aox1t表达盒中aox1为启动子，aox1为终止子；所述aox1启动子的核苷酸序列如seq id no：23所示，所述aox1终止子序列的核苷酸序列如seq id no：24所示，所述tef1启动子序列的核苷酸序列如seq id no：25所示。
6.如权利要求3所述的生物合成方法，其特征在于，所述步骤3还包括：包含所述关键酶基因hem1，hem2，hem3，hem4，hem12，hem13，hem14，hem15的表达盒的线性化片段获取方法为pcr，其通用引物为：
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