【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌及其应用，属于生物。
技术介绍
1、目前市场中绝大部分的丁二酸为石化法制得，主要通过顺丁烯二酸酐或反丁烯二酸在催化剂作用下加氢反应制得，而石油资源紧缺，环境污染巨大，所以急需一种绿色的可替代的丁二酸制备方法。而微生物合成法采用碳水化合物这种可再生原料作为初始碳源，该方法具有低成本，对环境友好，可再生等优点。并且，微生物合成丁二酸的过程中还会吸收二氧化碳，可以有效促进低碳经济的实现。因此利用微生物法生产丁二酸代替传统的石化途径已成为当前的发展趋势。
2、现有技术中，微生物发酵制备丁二酸的产量仍有限，规模化生产成本高。如cn114395518a公开了一种重组大肠杆菌，其基于细胞膜改造提高大肠杆菌抗逆性和产物合成性能，通过导入表达了来自谷氨酸棒状杆菌的氧化应激调节酶的基因whib与来自铜绿假单胞菌的不饱和脂肪酸顺反异构酶的基因cti，在5l发酵罐中发酵180h产量达到78.05g/l。但由于原核生物的局限性，而谷氨酸棒状杆菌发酵生产丁二酸具有成本低廉，利用可再生的农业资源包括二氧化碳作为原料，避免了对石化原料的依赖，保证了稳定的价格，同时减少了环境污染等优势，目前研究者把目光聚集在谷氨酸棒状杆菌上。其在丁二酸的微生物合成中取得了很大的进展，如cn103509747a中公开了一种用于厌氧转化生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌，将来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶克隆到谷氨酸棒状杆菌(atcc13032)中，并且用同源重组的方式敲除该谷氨酸棒状杆菌的乳酸脱氢酶基因，以细胞重
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种高产丁二酸的重组谷氨酸棒状杆菌，发酵制备丁二酸时产率高，规模化生产成本低，具有广阔的应用前景。
2、第一方面，本专利技术提供一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或氧化应激调节酶编码基因whib。
3、本专利技术发现了强化表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck或氧化应激调节酶编码基因whib，均可使丁二酸产量提高，并且当两个基因同时强化时，丁二酸产量升高最为显著，可达出发菌株的134.7％。因此，pck和whib两个基因同时强化表达在提高丁二酸产量方面具有意想不到的协同增效作用。
4、此外本专利技术所述群体感应基因表达盒comqxpa，可以根据菌液活菌数来调控目的基因的开启和关闭。本文中该表达盒用于调控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的表达。在进入无氧环境时，菌株即开启丁二酸的合成，随着丁二酸浓度的增加，菌株面临生长与代谢的双重胁迫，当引入群体感应基因表达盒comqxpa，当菌株活菌数下降到一定数量时，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck停止表达，此时菌株代谢合成丁二酸的压力减少，当菌落重新生长到一定数量时，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck重新开启，即引入该系统谷氨酸棒状杆菌在无氧发酵合成丁二酸时受到的胁迫更小，含有该系统的菌株的发酵终od600更高。结果显示，含有群体感应表达盒、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和氧化应激调节酶编码基因whib的菌株，较磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的菌株的产量高，较出发菌株提高了53.6％。
5、进一步地，所述谷氨酸棒状杆菌还异源表达了群体感应基因表达盒comqxpa。
6、进一步地，所述群体感应基因表达盒comqxpa的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的核苷酸序列如seq idno.2所示。
8、进一步地，所述氧化应激调节酶编码基因whib的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9、进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck由psrfa启动子调控表达。
10、具体地，本专利技术所述的谷氨酸棒状杆菌含有群体感应基因诱导系统，该系统包括含有群体感应基因表达盒comqxpa和psrfa启动子，待调节的目的基因(本专利技术中为pck、或pck和whib)位于psrfa启动子下游。
11、进一步地，所述psrfa启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12、进一步地，本专利技术所述用于高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌以谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc 13032为出发菌。
13、进一步地，在本专利技术的一个实施例中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或氧化应激调节酶编码基因whib、群体感应基因表达盒comqxpa的表达载体包括peki表达载体。当然，本专利技术所述基因表达载体可以选择本领域技术人员所熟知的用于谷氨酸棒状杆菌的任意表达载体。
14、第二方面，本专利技术提供了一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌的构建方法，包括以下步骤：
15、s1、将磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck、氧化应激调节酶编码基因whib分别或同时连接至表达载体上，得到重组质粒ppck、pwhib、ppck-whib；
16、s2、将群体感应基因表达盒comqxpa和启动子psrfa连接至s1所述的重组质粒ppck或ppck-whib上，制得重组质粒pcomqxpa-psrfa-pck或pcomqxpa-psrfa-pck-whib；
17、s3、将s2所述重组质粒pcomqxpa-psrfa-pck和/或pcomqxpa-psrfa-pck-whib导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，构建得到所述高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌。
18、第三方面，本专利技术提供如第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在生产丁二酸或含丁二酸的产品中的应用。
19、第四方面，本专利技术提供一种生产丁二酸的方法，采用第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌进行发酵合成丁二酸。
20、进一步地，包括以下步骤：
21、(1)菌种活化：将权利要求1-8任一项所述的谷氨酸棒状杆菌置于28-34℃，培养28-30h，制得一级种子液；
22、(2)扩大培养：将步骤(1)所述一级种子液置于28-34℃，培养28-30h，制得二级种子液；
23、(3)发酵培养和分离纯化：将步骤(2)所述二级种子液置于28-34℃，厌氧发酵培养72-144h；制得发酵培养液；并将发酵培养液过滤、吸附、脱色和结晶后，制得所述丁二酸。
24、本专利技术所述的生产丁二酸的方法中，应用第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌进行发酵生产，该谷氨酸棒状杆菌发酵生产丁二酸产量高，产率高。因此，本专利技术所述生产丁二酸的方法操作简单，易于工业放大，且规模化生产成本低。
25、本专利技术的有益效果：
26、本专利技术提供了一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌，pck、whib协同促进高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或氧化应激调节酶编码基因whiB。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌还异源表达了群体感应基因表达盒ComQXPA。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述群体感应基因表达盒ComQXPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述氧化应激调节酶编码基因whiB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的启动子包括PsrfA启动子。
7.根据权利要求6所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述PsrfA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
9.一种基于谷氨酸棒状杆菌高效生产丁二酸的方法，其特征在于：所述方法包括：
10.权利要求1-8中任一项所述的谷氨酸棒状杆菌在生产丁二酸或含丁二酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效生产丁二酸的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck和/或氧化应激调节酶编码基因whib。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌还异源表达了群体感应基因表达盒comqxpa。
3.根据权利要求2所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述群体感应基因表达盒comqxpa的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶编码基因pck的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌，其特征在于：所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李承，薛怡芸，姜睿康，李振，张天元，
申请(专利权)人：苏州聚维元创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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