【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因重组疫苗，具体涉及一种表达疟疾抗原的感染性克隆及其应用。
技术介绍
1、麻疹病毒(measles virus，mv)是麻疹的病原体，属于副粘病毒科麻疹病毒属。麻疹是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。若无并发症，愈后良好。我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降。但在发展中国家仍是儿童死亡的一个主要原因。
2、mv载体有沪191、edmonston b、edmonston zagreb、schwarz等疫苗株。在此基础上开发了表达新型冠状病毒的刺突蛋白、基孔肯雅病毒(chikv)抗原蛋白等重组mv载体疫苗。chikv包膜蛋白与mv结合，产生了chikv病毒样颗粒(vlps)，显示出强烈的抗原特异性t细胞应答，有保护作用。mv-chikv疫苗成功完成ii期临床试验，并将准备进入iii期临床试验。因为重组mv疫苗诱导了长期、强体液和细胞免疫反应，mv又与乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人乳头瘤病毒hpv16和hpv18或幽门螺杆菌等通过体液传播的病原体结合，这些重组mv疫苗在动物试验中表现出显著的抗体反应，证明了减毒mv的高免疫诱导能力。
3、疟原虫属于单细胞真核生物。感染人体的疟原虫主要包含5种：恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、三日疟原虫(p.malariae)、卵形疟原虫(p.ovale)和诺氏疟原虫(p.knowlesi)。其中恶性疟原虫致死率高，会在血液中迅速
4、在rts,s/as01e的基础上，英国詹纳研究所研制的r21疟疾疫苗，减少了hbsag在vlp中的占比，提高了csp的比例。r21/matrix-mtm的临床iii期临床安全性和有效性试验(nct04704830)显示5-36个月的幼儿在3针5μgr21/50μgmm免疫后，12个月内在季节性地点(季节性疟疾传播率高的地点)的效力(发生临床疟疾)为75％，在标准地点(疟疾全年传播的地点)的效力为68％，第一个达到世界卫生组织规定的75％的疗效目标。目前已通过世界卫生组织的预认证。
5、重组载体疫苗是一种整合多个病毒基因的新型疫苗。其原理是：将病毒a的中和表位基因片段插入到病毒b的基因组中，获得一种重组病毒，该病毒可以表达病毒a的中和抗原(或进一步形成病毒a的病毒样颗粒)，可引发机体产生相应抗体，并产生针对病毒a和b的记忆b细胞和t细胞。将此重组病毒作为免疫原，制备得到的疫苗，即为重组载体疫苗。重组载体疫苗仅需培养一种毒株，制备出一种高滴度病毒，选择一种病毒的冻干稳定剂和冻干工艺，即可制成。
6、目前尚未见将恶性疟原虫csp蛋白和hbsag(形成病毒样颗粒)构建入麻疹病毒反基因组的重组麻疹载体疫苗。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是将编码恶性疟原虫3d7环子孢子蛋白的基因片段和乙型肝炎表面抗原基因整合，使之通过麻疹病毒载体获得感染性克隆，在经病毒拯救后能得到表达环子孢子蛋白的乙型肝炎病毒表面抗原病毒样颗粒，从而可制成预防疟疾的重组载体疫苗。
2、本专利技术提供了一种基因片段，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
3、本专利技术还提供了一种表达疟疾抗原的感染性克隆，它是连接有核苷酸序列如seqid no.2的重组载体；
4、所述重组载体包括麻疹病毒反基因组序列。
5、进一步地，所述核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段位于所述麻疹病毒反基因组中p基因与m基因之间的附加转录单元内。
6、更进一步地，它是连接有核苷酸序列如seq id no.2的麻疹病毒载体。
7、更进一步地，所述麻疹病毒载体是以edmonston zagreb疫苗株反基因组构建的载体；
8、所述载体的构建方法为：
9、麻疹edmonston zagreb疫苗株反基因组的5’端插入t7启动子和锤头核酸酶序列，反基因组的3’端插入t7终止子和丁型肝炎病毒核酶序列，p基因和m基因之间引入附加转录单元，最后将经修饰的麻疹edmonston zagreb疫苗株反基因组连接到pt7-mcs载体上，即得；
10、所述附加转录单元的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11、本专利技术还提供了一种重组病毒，它是携带表达核苷酸序列如seq id no.2所示基因片段的重组麻疹病毒。
12、进一步地，它是前述的感染性克隆与4种辅助质粒共转染宿主细胞后复制包装而成；
13、其中4种辅助质粒分别是携带表达麻疹n蛋白、麻疹p蛋白、麻疹l蛋白和t7 rna聚合酶基因的质粒。
14、进一步地，所述宿主细胞包括bsr-t7细胞和/或vero细胞。
15、进一步地，所述转染是通过lipofectamine 3000试剂转染。
16、进一步地，所述感染性克隆与表达麻疹n蛋白、麻疹p蛋白、麻疹l蛋白和t7 rna聚合酶的质粒，以及lipofectamine 3000试剂的质量体积比为12μg：8μg：4μg：1μg：4μg：0.075ml。
17、本专利技术还提供了一种前述重组病毒在制备预防和/治疗疟疾感染的药物中的用途。
18、本专利技术最后提供了一种预防疟疾的疫苗，它是以前述的重组病毒为抗原，加上药学上可接受的辅料制备而成的疫苗。
19、本专利技术所述“反基因组序列”是指：病毒基因组的反向互补序列，一般为dna。由于麻疹病毒是rna病毒，直接使用基因组rna构建质粒的技术难度较大，所以要使用麻疹病毒的反基因组序列(dna形式)。
20、本专利技术将编码恶性疟原虫3d7环子孢子蛋白的基因片段和乙型肝炎表面抗原基因，通过特定的柔性片段基因连接后，在插入到麻疹病毒载体中得到的感染性克隆，经病毒拯救能获得表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达疟疾抗原的感染性克隆，其特征在于：它是连接有核苷酸序列如SEQ IDNO.2的重组载体；
3.根据权利要求2所述的感染性克隆，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因片段位于所述麻疹病毒反基因组中P基因与M基因之间的附加转录单元内。
4.根据权利要求2或3所述的感染性克隆，其特征在于：它是连接有核苷酸序列如SEQID NO.2的麻疹病毒载体。
5.根据权利要求4所述的感染性克隆，其特征在于：所述麻疹病毒载体是以EdmonstonZagreb疫苗株反基因组构建的载体；
6.一种重组病毒，其特征在于：它是携带表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因片段的重组麻疹病毒。
7.根据权利要求6所述的重组病毒，其特征在于：它是权利要求1～5任一所述的感染性克隆与4种辅助质粒共转染宿主细胞后复制包装而成；
8.根据权利要求7所述的重组病毒，其特征在于：所述宿主细胞包括BSR-T7细胞和/或Vero细胞
9.权利要求6～8任一项所述重组病毒在制备预防和/治疗疟疾感染的药物中的用途。
10.一种预防疟疾的疫苗，其特征在于：它是以权利要求6所述的重组病毒为抗原，加上药学上可接受的辅料制备而成的疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.一种表达疟疾抗原的感染性克隆，其特征在于：它是连接有核苷酸序列如seq idno.2的重组载体；
3.根据权利要求2所述的感染性克隆，其特征在于：所述核苷酸序列如seq id no.2所示的基因片段位于所述麻疹病毒反基因组中p基因与m基因之间的附加转录单元内。
4.根据权利要求2或3所述的感染性克隆，其特征在于：它是连接有核苷酸序列如seqid no.2的麻疹病毒载体。
5.根据权利要求4所述的感染性克隆，其特征在于：所述麻疹病毒载体是以edmonstonzagreb疫苗株反基...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘兰军，容新宗，武志强，杨盛理，田嘉瑶，陈宗香，周珂，
申请(专利权)人：成都生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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