【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种对蚊虫进行基因编辑调控蚊媒病毒感染的方法。
技术介绍
1、近年来，登革热、寨卡、疟疾等蚊媒传染病的全球发病率显著上升，对公共卫生构成重大挑战。目前，绝大多数蚊媒传染病针对内潜伏期(人体感染期)尚无有效治疗方案和预防性疫苗，主要防控策略是针对外潜伏期(蚊虫感染期)采用环境防制和化学防制为主的综合防制策略来切断蚊媒传播途径。然而，随着蚊虫抗药性的逐年增加以及环境保护等问题，传统的防制策略受到前所未有的挑战。随着基因编辑技术的发展，针对外潜伏期的蚊虫免疫生物阻断研究已成为当今阻断蚊媒病传播的重要研究方向。
2、crispr/cas系统是古细菌的一种获得性免疫系统，通过cas蛋白切割噬菌体dsdna，从而破坏噬菌体基因组，达到细菌免疫噬菌体的目的。crispr/cas9是cas系统ⅱ型家族的一种核酸内切酶，能够对基因组ngg pam结构向5’方向第3和第4个碱基之间进行定点剪切，造成dna双链断裂。再经细胞dna修复机制非同源末端连接和同源修复将断开的dna链重新连接在一起，从而实现基因组dna序列的编辑。crispr/cas9技术的出现为开展蚊虫生理、生化、发育、宿主与病原体关系等诸多方面分子生物基础研究提供了靶标特异性的修饰工具，给蚊媒控制技术的发展带来了新的契机。
3、近年来已有一些采用基因编辑技术以避免蚊虫疾病传播的报道。如美国陆军合作生物技术研究所和加州大学圣巴巴拉分校的研究人员使用了crispr/cas9基因编辑工具，以雄蚊生育能力相关基因为目标，对埃及伊蚊进行了“绝育
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术针对蚊媒传染病外潜伏期提供了一种基因编辑防控蚊媒病毒感染的方法，通过对蚊虫基因组特定区域进行敲除，降低了蚊媒病毒感染的概率，为这类疾病的处理提供了新的方向。
2、本专利技术的第一个目的是提供敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质在制备蚊媒传染病防治产品中的应用。
3、进一步地，部分敲除包括敲除seq id no.2所示基因序列的第73-99位碱基或其同源序列。
4、进一步地，所述敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质包括crispr/cas系统、sirna、shrna、慢病毒包裹的序列等。
5、进一步地，所述crispr/cas系统包括sgrna和cas9核酸酶。所述cas9核酸酶利用所述sgrna的识别和定位完成对目的基因片段的切割，导致蚊虫或蚊虫细胞内的目的基因片段断裂，从而发生同源重组修复或非同源末端连接，进而造成碱基移码突变实现基因敲除的目的。
6、进一步地，所述sgrna以seq id no.2所示序列或其中一部分序列为靶点进行设计。
7、进一步地，所述sgrna针对seq id no.3所示的靶点进行设计。
8、进一步地，所述sgrna的序列如seq id no.4所示。
9、进一步地，所述蚊媒传染病防治包括但不限于对蚊虫或蚊虫细胞进行编辑降低病毒感染概率的步骤。
10、进一步地，所述蚊媒传染病包括但不限于登革热、寨卡、疟疾、丝虫病、乙型脑炎、包虫病、蛔虫病、黄热病、基孔肯雅热病等，即防控登革热病毒(denv)、寨卡病毒(zikv)、疟疾虫、丝虫、乙型脑炎病毒、棘球绦虫、蛔虫、黄热病毒、基孔肯雅病毒(chikv)等的感染。
11、本专利技术首次利用crispr/cas9技术在埃及伊蚊中对mal1进行基因敲除，获得mal1基因部分敲除的埃及伊蚊，后续功能验证实验表明：与野生型埃及伊蚊相比，该mal1基因部分敲除的埃及伊蚊感染病毒后的病毒载量有所下降，说明抑制mal1基因的物质可用于防治蚊虫传播的疾病。同时本专利技术制备的mal1基因部分敲除的埃及伊蚊可作为蚊虫与病毒相互作用及蚊虫代谢研究的体内研究模型，同时本专利技术对蚊虫进行基因编辑的成功也使得对更多非模式生物进行基因编辑成为可能。
12、本专利技术的第二个目的是提供一种预防或治疗蚊媒传染病药物(针对蚊虫感染期)，含有敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质。
13、进一步地，所述蚊媒传染病药物施用于蚊虫或蚊虫细胞。
14、进一步地，所述敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质包括crispr/cas系统、sirna、shrna、慢病毒包裹的序列等。
15、进一步地，所述crispr/cas系统包括sgrna和cas9核酸酶。
16、进一步地，所述sgrna以seq id no.2所示序列或其中一部分序列为靶点进行设计。
17、进一步地，所述sgrna针对seq id no.3所示的靶点进行设计。
18、进一步地，所述sgrna的序列如seq id no.4所示。
19、进一步地，所述蚊媒传染病药物用于以下至少一种场景：
20、1)抑制蚊虫或蚊虫细胞病毒感染；
21、2)防治蚊虫传播的疾病；
22、3)制备病毒感染水平降低的转基因蚊虫。
23、本专利技术的第三个目的是提供一种降低蚊虫或蚊虫细胞病毒感染水平的方法，包括敲除或部分敲除(全长或一部分片段)蚊虫或蚊虫细胞中seq id no.2所示基因序列或其同源序列的步骤。
24、进一步地，包括敲除蚊虫或蚊虫细胞中seq id no.2中aatgaagatctttgttccacttctaag片段或其同源序列的步骤。
25、进一步地，所述敲除的方式包括但不限于，将包含seq id no.5的序列替换为包含seq id no.6的序列、靶向敲除aatgaagatctttgttccacttctaag片段等。
26、当然，本专利技术也提供了一种制备病毒感染水平降低的转基因蚊虫的方法，包括如下1)或2)：
27、1)抑制蚊虫中mal1蛋白质活性或降低蚊虫中mal1蛋白质含量；
28、2)将蚊虫中对应于序列表中seq id no.5所示的dna分子替换为对应于序列表中seq id no.6所示的dna分子。
29、进一步地，所述方法还包括将所述sgrna和cas9核酸酶显微注射入蚊卵的步骤。优选地，所述sgrna的终浓度为20-60ng/ul，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.敲除或部分敲除SEQ ID NO.2所示基因序列或其同源序列的物质在制备蚊媒传染病防治产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：部分敲除包括敲除SEQ ID NO.2所示基因序列的第73-99位碱基或其同源序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除或部分敲除SEQ ID NO.2所示基因序列或其同源序列的物质包括CRISPR/Cas系统、siRNA、shRNA或慢病毒包裹的序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cas系统包括sgRNA和Cas9核酸酶；所述sgRNA选自以下至少一项：
5.一种蚊媒传染病药物，其特征在于：所述蚊媒传染病药物含有以下至少一项：
6.根据权利要求5所述的蚊媒传染病药物，其特征在于：所述蚊媒传染病药物施用于蚊虫或蚊虫细胞。
7.一种降低蚊虫或蚊虫细胞病毒感染水平的方法，其特征在于：包括敲除或部分敲除蚊虫或蚊虫细胞中SEQ ID NO.2所示基因序列或其同源序列的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在
9.一种病毒感染水平降低的蚊虫模型或蚊虫细胞模型的构建方法，其特征在于：包括敲除或部分敲除蚊虫或蚊虫细胞基因组上SEQ ID NO.2所示基因序列或其同源序列的步骤。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：蚊虫模型的具体构建方法包括：
...【技术特征摘要】
1.敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质在制备蚊媒传染病防治产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：部分敲除包括敲除seq id no.2所示基因序列的第73-99位碱基或其同源序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除或部分敲除seq id no.2所示基因序列或其同源序列的物质包括crispr/cas系统、sirna、shrna或慢病毒包裹的序列。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述crispr/cas系统包括sgrna和cas9核酸酶；所述sgrna选自以下至少一项：
5.一种蚊媒传染病药物，其特征在于：所述蚊媒传染病药物含有以下至少一项：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰策介，李满金，程进，刘全超，邹亚明，朱丁，周伟杰，
申请(专利权)人：无锡市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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