【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及阴道分泌物的检测，具体涉及一种念珠菌阴道毛滴虫阴道加德纳菌抗原诊断试剂盒及应用。
技术介绍
1、通过对女性阴道分泌物的检测，能够有效检测和判断其炎症情况。白色念珠菌（ candida albicans， c.albicans）可引起最常见的外阴阴道炎症，其与抗生素滥用、免疫缺陷、妊娠、激素治疗以及难治性糖尿病密切相关。阴道毛滴虫（ trichomonas vaginalis， t.vagnialis）是寄生在人体泌尿生殖道的一种常见病原体，可引起阴道毛滴虫病。滴虫是最常见的非病毒的性病，它与许多围产期并发症，男性和女性生殖道感染和传播艾滋病毒的发病率增加有关。阴道加德纳菌（gardnerella vaginal， g.vagnialis）是一类革兰染色阴性或阳性的短杆菌，是女性细菌性阴道病的主要病原菌之一。它与不良妊娠结局、妇科炎症和艾滋病毒的传播复制有关。
2、现有的阴道分泌物检测方法主要包括白带外观和ph检测、显微镜镜检、培养法、生化酶学法、免疫学方法及分子生物学方法等。例如，念珠菌阴道炎患者白带为白色豆腐渣样分泌物，呈凝乳状，而正常白带的颜色像鸡蛋清一样，清亮无色或白色、不均匀、絮状。然而，这些方法不能对阴道分泌物中的多种病原体进行同时检测，极大地限制其应用。
技术实现思路
1、本专利技术提
2、本专利技术目的之一提供一种阴道分泌物的检测试剂盒。该试剂盒包括负载白色念珠菌（ c.albicans）单链抗体、阴道毛滴虫（ t.vagnialis）单链抗体及阴道加德纳菌（ g.vagnialis）单链抗体的脂质体的纳米颗粒，所述白色念珠菌单链抗体如seq id no:1所示，所述阴道毛滴虫单链抗体如seq id no:2所示，所述阴道加德纳菌单链抗体如seq idno:3所示。
3、本专利技术目的之一提供一种阴道分泌物的检测试剂盒的制备方法。该方法包括：制备负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒作为一抗；分别用三种单链抗体免疫昆明小鼠分离血清后，进行hrp标记，即可得到三种hrp标记抗体，将三种hrp标记抗体等重量混合作为二抗；以所述一抗和所述二抗为基础构建双抗夹心法的elisa检测试剂盒。
4、进一步地，所述负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒的制备方法包括：制备dspe-peg2k-mal胶束，还原单链抗体，连接反应以得到脂质体，配制活化液，活化fe3o4-peg-cooh，将所述脂质体负载至所述活化的fe3o4-peg-cooh上。
5、进一步地，制备所述dspe-peg2k-mal胶束的步骤包括：用氮气将含dspe-peg2k-mal的氯仿储备液吹干成膜；加入30mm hepes缓冲液，ph6.8，dspe-peg2k-mal终浓度为1.4mm；轻轻摇动后超声水合，100w，30min，制备成dspe-peg2k-mal胶束。
6、进一步地，还原单链抗体的步骤包括：将白色念珠菌（ c.albicans）单链抗体（seqid no:1），阴道毛滴虫（ t.vagnialis）单链抗体（seq id no:2）和阴道加德纳菌（ g.vagnialis）单链抗体（seq id no:3）分别与tcep按照摩尔比1:10的质量比例混合以及不加tcep的样品组，4℃还原1h，分别得到还原的白色念珠菌单链抗体、还原的滴虫单链抗体和还原的加德菌单链抗体。
7、进一步地，所述连接反应包括：将还原的白色念珠菌单链抗体、还原的滴虫单链抗体和还原的加德菌单链抗体等摩尔比例混合，后加入10倍摩尔比例的dspe-peg2k-mal，充满氮气后封闭反应体系，放于sc20恒温振荡反应器，10℃，300rpm，连接16h得到连接三种单链抗体的连接产物，即为脂质体保存于4℃冰箱。
8、进一步地，将所述脂质体负载至所述活化的fe3o4-peg-cooh上的步骤包括：调整fe3o4-peg-cooh浓度为1g/l，取溶液50ml，加入40mg 脂质体室温震荡2h，加入终浓度为30mm的乙醇胺终止反应，磁性分离装置去除多余的脂质体和阻断剂，3000rpm离心10min，用ph7.4的pbs缓冲液漂洗3次，得到负载脂质体的纳米颗粒。
9、本专利技术目的之一提供一种侧向流层析试纸条。该试纸条以层析方向依次包括pvc板、样品层、吸水纸、玻璃纤维素膜和硝酸纤维膜。其中，样品层和吸水纸分别被配置于所述pvc板的两端，样品层用于吸收添加于其表面的样品液，吸水纸用于从所述样品层中吸收所述样品液以使得所述样品液由所述样品层向所述吸水纸流动，即为向所述层析方向流动。所述玻璃纤维素膜与所述硝酸纤维膜依所述层析方向依次被配置于所述样品层与所述吸水纸之间，以使得所述样品液以所述层析方向流动而经过所述玻璃纤维素膜。且所述玻璃纤维素膜的一端被覆盖于所述样品层的一端下、所述玻璃纤维素膜的另一端覆盖于所述硝酸纤维膜上。所述玻璃纤维素膜涂敷有负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒和生物素标记的纳米颗粒。其中，所述硝酸纤维膜以层析方向依次配置检测线和控制线。所述检测线上包被上述实施例提供的负载三种抗体的脂质体。所述控制线上包被链霉亲和素。
10、本专利技术目的之一提供一种侧向流层析试纸条的制备方法。该方法包括：制备生物素标记的纳米颗粒，样品层和玻璃纤维素膜的处理，硝酸纤维膜的处理以及制备试纸条。
11、由于超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体表面带羧基，可以直接与捕获抗体上的氨基形成共价键，相对于胶体金、胶乳的静电吸附，这种连接方式更加稳定可靠；超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体作为一种超顺磁性质材料，只有在磁场中才能显示出磁性，因此磁性微球在溶液中不容易发生聚集沉淀，直接使用磁力架进行磁分离清洗，省去了繁琐的离心过程；实现定量检测。其次，本专利技术采用超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体成功替换了免疫层析中的胶体金，检测成本显著降低；并且由于将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体与负载三种抗体的脂质体成功偶联，形成负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒，将超顺磁氧化铁纳米颗粒聚集体的磁学性能和抗体、抗原特异免疫反应结合，建立了快速、特异、简便、灵敏的免疫层析检测方法。通过用普鲁士蓝染色，能够进一步将检测灵敏度提高，实现定量检测。
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1.一种阴道分泌物的检测试剂盒，包括负载白色念珠菌（C.albicans）单链抗体、阴道毛滴虫（T.vagnialis）单链抗体及阴道加德纳菌（G.vagnialis）单链抗体的脂质体的纳米颗粒，所述白色念珠菌单链抗体如SEQ ID NO:1所示，所述阴道毛滴虫单链抗体如SEQ IDNO:2所示，所述阴道加德纳菌单链抗体如SEQ ID NO:3所示。
2.一种阴道分泌物的检测试剂盒的制备方法，包括：
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒的制备方法包括：制备DSPE-PEG2k-MAL胶束，还原单链抗体，连接反应以得到脂质体，配制活化液，活化Fe3O4-PEG-COOH，将所述脂质体负载至所述活化的Fe3O4-PEG-COOH上。
4.根据权利要求3所述的制备方法，制备所述DSPE-PEG2k-MAL胶束的步骤包括：用氮气将含DSPE-PEG2k-MAL的氯仿储备液吹干成膜；加入30mM HEPES缓冲液，pH6.8，DSPE-PEG2k-MAL终浓度为1.4mM；轻轻摇动后超声水合，100W，30min，制备成D
5.根据权利要求3所述的制备方法，还原单链抗体的步骤包括：将白色念珠菌（C.albicans）单链抗体（SEQ ID NO:1），阴道毛滴虫（T.vagnialis）单链抗体（SEQ ID NO:2）和阴道加德纳菌（G.vagnialis）单链抗体（SEQ ID NO:3）分别与TCEP按照摩尔比1:10的质量比例混合以及不加TCEP的样品组，4℃还原1h，分别得到还原的白色念珠菌单链抗体、还原的滴虫单链抗体和还原的加德菌单链抗体。
6.根据权利要求3所述的制备方法，所述连接反应包括：将还原的白色念珠菌单链抗体、还原的滴虫单链抗体和还原的加德菌单链抗体等摩尔比例混合，后加入10倍摩尔比例的DSPE-PEG2k-MAL，充满氮气后封闭反应体系，放于SC20恒温振荡反应器，10℃，300rpm，连接16h得到连接三种单链抗体的连接产物，即为脂质体保存于4℃冰箱。
7.根据权利要求3所述的制备方法，将所述脂质体负载至所述活化的Fe3O4-PEG-COOH上的步骤包括：调整Fe3O4-PEG-COOH浓度为1g/L，取溶液50mL，加入40mg 脂质体室温震荡2h，加入终浓度为30mM的乙醇胺终止反应，磁性分离装置去除多余的脂质体和阻断剂，3000rpm离心10min，用pH7.4的PBS缓冲液漂洗3次，得到负载脂质体的纳米颗粒。
8.一种侧向流层析试纸条，以层析方向依次包括PVC板、样品层、吸水纸、玻璃纤维素膜和硝酸纤维膜；
9.一种侧向流层析试纸条的制备方法，包括：制备生物素标记的纳米颗粒，样品层和玻璃纤维素膜的处理，硝酸纤维膜的处理以及制备试纸条。
...【技术特征摘要】
1.一种阴道分泌物的检测试剂盒，包括负载白色念珠菌（c.albicans）单链抗体、阴道毛滴虫（t.vagnialis）单链抗体及阴道加德纳菌（g.vagnialis）单链抗体的脂质体的纳米颗粒，所述白色念珠菌单链抗体如seq id no:1所示，所述阴道毛滴虫单链抗体如seq idno:2所示，所述阴道加德纳菌单链抗体如seq id no:3所示。
2.一种阴道分泌物的检测试剂盒的制备方法，包括：
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述负载三种抗体的脂质体的纳米颗粒的制备方法包括：制备dspe-peg2k-mal胶束，还原单链抗体，连接反应以得到脂质体，配制活化液，活化fe3o4-peg-cooh，将所述脂质体负载至所述活化的fe3o4-peg-cooh上。
4.根据权利要求3所述的制备方法，制备所述dspe-peg2k-mal胶束的步骤包括：用氮气将含dspe-peg2k-mal的氯仿储备液吹干成膜；加入30mm hepes缓冲液，ph6.8，dspe-peg2k-mal终浓度为1.4mm；轻轻摇动后超声水合，100w，30min，制备成dspe-peg2k-mal胶束。
5.根据权利要求3所述的制备方法，还原单链抗体的步骤包括：将白色念珠菌（c.albicans）单链抗体（seq id no:1），阴道毛滴虫（t.vagnialis）单链抗体（seq id...
【专利技术属性】
技术研发人员：段虎，刘丽，
申请(专利权)人：北京泰格科信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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