一种提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法技术

本发明专利技术提供了一种提高脂肪酶热稳定性的理性设计方法，属于酶工程领域。通过分子动力学模拟初步确定待改造脂肪酶的柔性区域，经过结构分析来确定改造区域，再经多种计算工具综合衡量来确定改造位点，采用NNK简并密码子进行定点饱和突变来建立突变体文库，再采用基于分光光度法的微孔板筛选方法筛选出热稳定性提高的优异突变体。本发明专利技术的南极假丝酵母脂肪酶B突变体在50℃下的半衰期较野生型提高了9倍，同时比酶活也较野生型提升了6.32％。本发明专利技术突破了“稳定性活性的权衡”，实现了脂肪酶热稳定性的改善，这有利于脂肪酶突变体在食品、药品或生物柴油等领域的工业应用中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种基于结构分析的脂肪酶改造设计方法，从而提升脂肪酶的热稳定性。

技术介绍

1、脂肪酶(e.c.3.1.1.3)是丝氨酸水解酶，具有经典的α/β水解酶结构域，具有交替的α螺旋和β链，以及由ser、his和asp残基组成的催化三联体。脂肪酶可用于水解、酯化、酯交换等多种反应，在催化各种具有工业价值的过程中取得了成功。此外，对新型脂肪酶生产的需求也与日俱增。来自南极假丝酵母的脂肪酶b(calb)是工业中最重要的酶，是制备单一手性异构体药物、合成生物可降解聚酯等的高效催化剂。开发更多功能改善型calb并阐明其机制将为科学或工业应用带来巨大效益。在之前的研究中发现，超过60℃时calb会逐渐失活，导致反应速率下降，而且多种底物(如甘油和碳酸二甲酯)需在较高温度下才能完全溶解，因此，进一步提高calb的热稳定性对于其工业应用至关重要。

2、热稳定性被认为是衡量酶在工业应用中可行性的一个重要参数。一般来说，较高的热稳定性会使酶在工业中更具竞争力和更受欢迎。因为在较高的温度下操作是非常有利的，因为(i)催化反应速度大约每10本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(5)中所述虚拟筛选包括以下步骤：对筛选到的所有单突变体进行重组，使用FoldX计算所有多重突变体的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，选择结合自由能较低的至少前20个突变体，留待下一步实验验证。

3.根据权利要求1所述的提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(6)中所述的热稳定性测定包括相对酶活、残余酶活的测定和热稳定性参数的测定。

4.利用权利要求1所述的方法得到南极假丝酵母脂肪酶...

【技术特征摘要】

1.一种提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高脂肪酶热稳定性的分子改造设计方法，其特征在于，步骤(5)中所述虚拟筛选包括以下步骤：对筛选到的所有单突变体进行重组，使用foldx计算所有多重突变体的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，选择结合自由能较低的至少前20个突变体，留待下一步实验验证。

3.根据权利要求1所述的提高脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡燚，种温雅，张子晗，年彬彬，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：