【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及天然植物化学领域，具体为一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺。
技术介绍
1、藏药余甘子为大戟科植物余甘子phyllanthusemblical.的干燥果实，藏名居如拉；《藏药志》中记载其性味甘、酸、涩，有除湿化痰，凉血清热，生津止咳功效，能治肝病、胆病、消化不良、眼病及培根、赤巴等病。余甘子富含多种鞣质、有机酸和黄酮，现代研究发现其水提物能改善糖尿病大鼠的糖脂代谢、肝功能、胰岛素抵抗，可有效抑制结肠癌生长，还有较强抗氧化能力；
2、现有针对抑菌方面的余甘子提取物主要为醇提物、精油、多糖，且局限于初步提取物，未探究其抑菌作用的具体活性化学小分子，同时，目前余甘子水溶性小分子的提取及相关成分分析未见报道；针对上述问题，专利技术人提出一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，检测抑菌活性并对其成分进行分析鉴定，用于解决上述问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，包括以下步骤：
2、s1、余甘子果实预处理
3、将余甘子果实打碎，称量，按1g:10ml比例加入超纯水，加热水提、离心，过滤膜；
4、s2、余甘子水溶性小分子的提取
5、在离心过滤后的上清中加入高浓度无水乙醇，4℃下密封静置过夜，醇沉样品离心后过滤，加热挥发除去乙醇和水，按原水提液体积重新加入超纯水搅拌加热溶解，过滤膜后得余甘子水溶性小分子提取液，4℃冷
6、优选地，所述余甘子水溶性小分子提取液的分析，由以下步骤组成：
7、a1、抑菌功能分析
8、水溶性小分子提取液用lb液体培养基二倍梯度稀释后备用，lb固体平板划线活化菌株后，挑取单菌落转移至浓度为0.9％的生理盐水中，将菌液浓度调至0.5麦氏浓度(1.5×108cfu/ml)，稀释100倍后，在96孔板中的各稀释浓度药液中加稀释后菌液，每组3个重复，以lb培养基为空白对照，轻微震荡后摇匀，37℃培养18～24小时，观察细菌生长情况，对比培养前后od600值变化；
9、a2、余甘子水溶性小分子提取物成分的鉴定
10、色谱条件：采用waters acquitytm premier hss t3色谱柱，规格2.1mm×100mm，1.8μm；以0.1％甲酸水溶液为流动相a，甲醇为流动相b进行梯度洗脱；
11、正离子模式：0～12min，0％～3％b；12～17min，3％～40％b；17～25min，40％～45％b；25～30min，45％～65％b；30～40min，65％～100％b；40～45min，100％～0％b；
12、负离子模式：0～18min，0％～5％b；18～20min，5％～40％b；20～25min，40％～42％b；25～30min，42％～100％b；30～35min，100～0％b；流速0.3ml/min，柱温30℃，进样量3μl；以上浓度均为体积百分数；
13、质谱条件：采用esi电喷雾离子源，氮气用作干燥、雾化和碰撞气体，在正、负离子模式下采集数据，2种模式采集条件均为离子源温度350℃，毛细管温度320℃，喷雾电压3.8kv，鞘气流速30l/h，辅助气流速15l/h，毛细管电压35v，管透镜电压110v，一级采用分辨率70000，二级17500分辨率，steppednce 20,40,60，在ms和ms/ms模式下扫描m/z 50～1500的质量范围记录光谱，二级质谱采用数据依赖型扫描，选取多个文献记载的余甘子水溶性小分子物质的离子进行碰撞诱导解离(cid)碎片扫描；
14、对质谱采集的数据进行分析，从而对藏药余甘子水溶性小分子成分进行分析鉴定。
15、优选地，在s1中，的离心参数为12000g离心60min，以更大效率分离沉淀大分子多糖、蛋白质。
16、优选地，在s1中，采用水提的方式进行提取，余甘子与水比例为1g:10ml，提取时间2h。
17、优选地，在s2中，使用高浓度乙醇沉淀去除大分子多糖及蛋白质，提取目的余甘子水溶性小分子。
18、优选地，在a1中，发现了余甘子水溶性小分子提取物的抗菌特性。
19、优选地，在a2中，采用waters acquitytm premier hss t3色谱柱，实现更好的分离效果。
20、优选地，在a2中，所述分析鉴定方法为：
21、首先，通过查阅文献获得关于余甘子化学成分的数据，在compound discover软件将关于化学成分的化合物的结构输入以建立一级数据库比对，同时导入中药成分高分辨质谱数据库(otcml)建立本地二级库进行二级碎片比对，结合线上检索一级数据资源库chemspider和二级数据资源库mzcloud进行分析比对鉴定成分；
22、然后参考hmdb、pmhub数据库上的化合物的精确质量数、质谱裂解碎片及特征碎片离子进行判断，确定最终筛选结果。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
24、1、本专利技术中，首次通过使用水提加高浓度乙醇沉淀技术对藏药余甘子水溶性小分子化学成分进行提取；
25、2、本专利技术中，在功能分析中发现了其水溶性小分子提取物有抑菌生物活性；
26、3、本专利技术中，通过对有效成分提取条件、色谱条件和质谱条件进行优化，在正负离子模式下建立了一种高效分离多种有效成分的方法，使用uplc-q-exactive-orbitrap-ms/ms技术，系统、准确地对余甘子中的水溶性小分子化学成分进行鉴定，并结合多个数据库(chemspider、mzcloud、pmhub、otcml、hmdb)，在compound discover 3.0数据分析处理软件结合碎片离子信息进行比对，提高了鉴定结果的准确性。正离子模式鉴定23个化合物，负离子模式鉴定出24个化合物，共鉴定出43个化合物，包括有机酸类、黄酮类、多酚类、鞣质类、氨基酸、嘌呤等多种类型的化合物，为进一步开展余甘子的药代动力学和药效物质基础研究提供了数据支持，为临床应用奠定了理论基础。
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1.一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺艺，其特征在于，所述余甘子水溶性小分子提取液的分析，由以下步骤组成：
3.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在S1中，的离心参数为12000g离心60min，以更大效率分离沉淀大分子多糖、蛋白质。
4.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在S1中，采用水提的方式进行提取，余甘子与水比例为1g:10mL，提取时间2h。
5.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在S2中，使用高浓度乙醇沉淀去除大分子多糖及蛋白质，提取目的余甘子水溶性小分子。
6.如权利要求2所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在A1中，发现了余甘子水溶性小分子提取物的抗菌特性。
7.如权利要求2所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及
8.如权利要求2所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在A2中，所述分析鉴定方法为：
9.如权利要求2所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，其特征在于，包括权利要求1-8所述的余甘子水溶性小分子的成分提取工艺的提取物。
...【技术特征摘要】
1.一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺艺，其特征在于，所述余甘子水溶性小分子提取液的分析，由以下步骤组成：
3.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在s1中，的离心参数为12000g离心60min，以更大效率分离沉淀大分子多糖、蛋白质。
4.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在s1中，采用水提的方式进行提取，余甘子与水比例为1g:10ml，提取时间2h。
5.如权利要求1所述的一种余甘子水溶性小分子的成分提取及其成分鉴定工艺，其特征在于，在s2中，使用高浓度乙...
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