一种木糖诱导型CRISPRa系统载体及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种木糖诱导型CRISPRa系统载体及其构建方法和应用，属于合成生物学工具技术领域，该系统载体的构建方法为：MCP‑VPR融合片段和sgRNA插入含有dCas9片段的pCRISPRyl SmaI位点，得pCRISPRa质粒；优化MS2结构，选取wtf6插入到sgRNA中，得GALsg4wtf6，之后插入pCRISPRa smaI位点，得到pCRISPRaGALsg4wtf6系统载体；将木糖传感器与该系统偶联，得木糖诱导型CRISPRa系统载体。本发明专利技术还公开该系统载体在检测解脂耶氏酵母细胞利用木糖能力中的应用。本发明专利技术证实转入该系统载体的解脂耶氏酵母能代谢木糖，检测菌株利用木糖的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及合成生物学工具，特别是涉及一种木糖诱导型crispra系统载体及其构建方法和应用。

技术介绍

1、crispra-基因调控技术是基于失活的dcas9蛋白融合转录激活因子可以随着grna通过碱基互补配对结合到感兴趣的基因位置。2018年，ian wheeldon教授在解脂耶氏酵母构建基于dcas9融合vpr转录因子的crispra系统，成功激活内源性纤维二糖代谢基因使解脂耶氏酵母能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长。但是这种激活方式使得每个dcas9只有一种调控方式。jesse g.zalatan在酿酒酵母中开发了基于rna结合蛋白的crispra系统，在sgrna中插入ms2或者pp7适配体，通过rna结合蛋白融合相应的转录因子，达到相应的激活效果，并且应用于调控紫色杆菌素及其前体的合成。长期的表达cas蛋白和持续的强化表达目标基因会影响细胞生长甚至让细胞失去表型，为了条件控制cas蛋白和目标基因的强化程度，添加诱导剂可以很好的解决这些问题。2021年suryang kwak在布拉迪酵母构建了基于半乳糖和cu2+诱导性crispra系统，使本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种木糖诱导型CRISPRa系统载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述引物P2F的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示；所述引物P3R的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pVPRHXbios1与pCRISPRaGALsg4wtf6系统载体偶联的方法如下：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述引物P14F和P14R的核苷酸序列如SEQ ID NO：28-29所示；所述引物P15F和P15R的核苷酸序列如SEQ ID NO：3...

【技术特征摘要】

1.一种木糖诱导型crispra系统载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述引物p2f的核苷酸序列如seq idno：5所示；所述引物p3r的核苷酸序列如seq id no：8所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pvprhxbios1与pcrispragalsg4wtf6系统载体偶联的方法如下：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述引物p14f和p14r的核苷酸序列如seq id no：28-29所示；所述引物p15f和p15r的核苷酸序列如seq id no：30-31所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述pvprhxbdes1与pcrispragalsg4wtf6系统载体偶联的方法如下：

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述引物p...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，钱涛，魏文平，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：