【技术实现步骤摘要】
一、本专利技术涉及医药领域，特别是一种肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法及应用。
技术介绍
0、二、
技术介绍
1、cd8+t细胞是杀伤肿瘤的关键效应细胞。在胃癌进展过程中，cd8+t细胞浸润不足，以及由于免疫抑制微环境导致的cd8+t细胞功能障碍，会降低其肿瘤杀伤能力。故促进胃癌肿瘤微环境中cd8+t细胞的浸润，逆转cd8+t细胞的耗竭，成为提高抗肿瘤免疫治疗的关键。最新研究表明，敲除胃癌细胞或cd8+t细胞中的lsd1能够促进cd8+t细胞在肿瘤部位的浸润，并下调pd-l1和pd-1的表达，逆转cd8+t细胞的耗竭。相较于敲除一种细胞中的lsd1,同时作用于胃癌细胞和cd8+t细胞中的lsd1能更好地恢复cd8+t细胞杀伤肿瘤的能力。故需要设计一种双靶向基因递送系统将敲除lsd1的质粒(sglsd1)分别递送到两种细胞中，从而产生协同抗肿瘤免疫治疗效果。
2、聚乙烯亚胺(pei)是目前研究最广泛的阳离子聚合物基因载体。但其存在转染效率低的缺点，因此，需要加以修饰以提高转染效率。研究表明，胍基化修饰是提高转染效率的一种有效方法。此外，为了靶向t细胞和肿瘤细胞，将靶向两种细胞的多肽分别修饰在pei表面将能够实现此效果。然而，如何在一个系统中实现两种质粒的共递送是需要解决的问题。醛基和伯氨基易形成亚胺键，亚胺键是一种酸敏感键，其在生理条件(ph＝7.4)下结构保持稳定，但在肿瘤微环境条件(ph＝6.5)时会发生水解断裂，因此，利用戊二醛两端的醛基和纳米粒中聚乙烯亚胺上的氨基形成亚胺键，将两种靶向性不
技术实现思路
0、三、
技术实现思路
1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本专利技术之目的就是提供一种肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法及应用，可有效解决原位重编程肿瘤细胞和t细胞问题，提高抗肿瘤免疫治疗效果，保证癌症治疗效果。
2、本专利技术解决的技术方案是，将聚乙烯亚胺和1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐在常温条件下反应，接着分别将靶向肿瘤细胞的多肽和靶向t细胞的多肽通过酰胺反应进行修饰，随后分别与sglsd1质粒缩合，再进行物理混合，加入戊二醛进行交联，最后将聚(2-乙基-2噁唑啉)包裹在外层形成稳定的核壳结构，得到肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统，具体包括以下步骤：
3、1)制备胍基化的聚乙烯亚胺(gpei)
4、取1-6g聚乙烯亚胺溶于3-8ml溶剂中，将其加入三颈烧瓶中并氮气保护，取1-6g1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐溶于5ml溶剂中，将其加入聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌反应10-35min，将1-6g三乙胺加入上述混合溶液中，室温搅拌24h，反应后的溶液装入500da透析袋中，透析48h后产物进行冻干干燥，得胍基化的聚乙烯亚胺(gpei)；
5、2)制备t细胞靶向载体(t-gpei)
6、取10-60mgt细胞靶向肽溶于1-6ml溶剂并装入三颈烧瓶中，充氮气进行保护，取3-8mgn-羟基琥珀酰亚胺和6-11mg(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于1ml溶剂中并将其加入上述三颈烧瓶中，室温搅拌12h，取20-70mg胍基化的聚乙烯亚胺加入2-7ml溶剂充分溶解，将其加入三颈烧瓶中，室温搅拌反应24h后将其装入1500da透析袋中透析48h充分去除未反应物质，透析后的产物冷冻干燥48h，得t细胞靶向肽修饰的胍基化的聚乙烯亚胺(t-gpei)；
7、所述的t细胞靶向肽为含有akmgeggwgandy序列的多肽链；
8、3)制备肿瘤细胞靶向载体(m-gpei)
9、取20-70mg肿瘤细胞靶向肽溶于3ml溶剂中，然后加入三颈烧瓶中并充氮气进行保护。再将溶有3-8mgn-羟基琥珀酰亚胺和8-13mg(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的溶剂溶液加入三颈烧瓶中，室温活化羧基12h。最后将溶有30-80mg胍基化的聚乙烯亚胺的溶剂溶液加入上述反应体系中，室温反应24h，反应后的溶液装入2500da透析袋透析48h，将产物冷冻干燥48h，得肿瘤细胞靶向肽修饰的胍基化的聚乙烯亚胺(m-gpei)；
10、所述的肿瘤细胞靶向肽为含有sgqyasyhcwcwrdpgrsggsk序列的多肽链；
11、4)配置t细胞靶向载体溶液和肿瘤细胞靶向载体溶液(tg、mg)
12、取步骤2)制备的t细胞靶向载体和步骤3)制备的肿瘤细胞靶向载体各30-80mg分别溶于40ml溶剂中，用1mol/l naoh溶液将上述两种溶液ph调至7.4，随后转移至50ml容量瓶中，用溶剂定容至50ml，摇匀，得浓度为1mg/ml的t细胞靶向载体溶液和肿瘤细胞靶向载体溶液，配置好的溶液用0.22μm微孔滤膜过滤；
13、5)合成t细胞靶向载体/质粒复合物和肿瘤细胞靶向载体/质粒复合物(tg/sg、mg/sg)
14、取两份分别为4-9ml、7-12mg的质粒，用溶剂将其稀释到0.01mg/ml，分别取50ml步骤4)制备的t细胞靶向载体溶液和肿瘤细胞靶向载体溶液，用溶剂将其稀释到0.1mg/ml，分别将其逐滴加入稀释后的质粒溶液中，不停震荡混匀，室温静置10min，得t细胞靶向载体/质粒复合物和肿瘤细胞靶向载体/质粒复合物；
15、6)肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统(p@cpg/sg)
16、取步骤5)中的t细胞靶向载体/质粒复合物和肿瘤细胞靶向载体/质粒复合物，将两种溶液等量混合，加入25％戊二醛溶液170-220ml，混匀后室温静置5min，取30-80mg聚(2-乙基-2噁唑啉)将其用溶剂配置成浓度为1mg/ml的溶液，量取300-800ml逐滴加入上述溶液中，室温静置10min，即得肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统。
17、所述的步骤1)-6)中溶剂为超纯水、ph＝7.4的pbs缓冲液、甲酰胺中的一种。
18、本专利技术所述的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
19、本专利技术所述的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统在制备高效递送基因中的应用。
20、本专利技术操作方便，方法稳定可靠，所制得的双靶向基因递送系统生物相容性好，滞留时间长，在肿瘤治疗方面可在原位重编程肿瘤细胞和t细胞、增加cd8+t细胞的浸润、逆转t细胞耗竭等多重功效，可有效提高原位编程肿瘤细胞和t细胞的效率，高效激活抗肿瘤免疫应答，是肿瘤治疗药物的创新，经济和社会效益本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法，其特征在于，将聚乙烯亚胺和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在常温条件下反应，接着分别将靶向肿瘤细胞的多肽和靶向T细胞的多肽通过酰胺反应进行修饰，随后分别与sgLSD1质粒缩合，再进行物理混合，加入戊二醛进行交联，最后将聚(2-乙基-2噁唑啉)包裹在外层形成稳定的核壳结构，得到肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统。
2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：所述的步骤1)-6)中溶剂为超纯水、pH＝7.4的PBS缓冲液、甲酰胺中的一种。
4.权利要求1-3任一项制备方法制备的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1-3任一项制备方法制备的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统在制备高效递送基因中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法，其特征在于，将聚乙烯亚胺和1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐在常温条件下反应，接着分别将靶向肿瘤细胞的多肽和靶向t细胞的多肽通过酰胺反应进行修饰，随后分别与sglsd1质粒缩合，再进行物理混合，加入戊二醛进行交联，最后将聚(2-乙基-2噁唑啉)包裹在外层形成稳定的核壳结构，得到肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统。
2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境响应型双靶向基因递送系统的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯琳，梁成林，张鹏迪，郭琳琳，李欣妮，蒋晓娟，张慧娟，张红岭，张振中，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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