【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及的是生物中，具体涉及的是一种高亲水性、重组人源胶原蛋白片段串联体的制备方法。
技术介绍
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技术介绍
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1、胶原蛋白ⅲ是构成人体多种组织的重要成分，尤其在血管壁、内脏和胚胎等组织中起到维持器官结构和弹性的关键作用。胶原蛋白管主要用于人工血管、血管狭窄和栓塞治疗用人工血管导管、神经修复导管等。其药用价值主要体现在创伤愈合、关节保健和骨骼健康方面；医美价值则主要体现在美容护肤、抗衰老和填充塑形方面。
2、天然的胶原本身具有止血功能，能促进血小板凝聚和血浆结块。胶原蛋白可作为细胞生长的依附和支架物，能诱导上皮细胞等的增殖。胶原蛋白的生物降解性，使得胶原蛋白可作为器官移植材料而被利用。胶原具有一点的机械强度，目前被广泛应用到美容的填充。目前，胶原蛋白作为生物医药和生物医用材料的新宠，其中胶原蛋白溶液主要用于修复皮肤组织、软组织填充材料、骨组织再生填料等；胶原蛋白海绵主要用于外科止血、口腔再吸收性敷料、组织填充、组织工程支架等，胶原蛋白膜主要用于促牙周腔膜的再生、人造皮肤、烧伤烫伤的皮肤覆膜、促皮肤角膜上皮细胞愈合等；胶原蛋白颗粒主要用于骨折与骨缺损填料、药物缓释等；
3、目前，通过蛋白酶解法，利用动物皮肤组织(猪皮、鱼皮、驴皮等)来生成胶原蛋白是一种方法，生产的胶原蛋白组成稳定，具有生物活性，但常常带有组成的不均一性、明显的抗原性和人兽共患病病毒的隐患，限制了它们在药用和医美领域的广泛应用。目前基因重组技术是生产重组人源胶原蛋白的主要方法，大肠杆菌表达胶原时易产生的致热原致使表达产物难
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的是提供一种重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的制备方法，这种重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的制备方法用于解决现有技术中重组胶原产量低、纯化分离耗资大，价格昂贵的问题。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案为：这种重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的制备方法包括以下步骤：
3、步骤一、构建表达重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的毕赤酵母工程菌，筛选获得高效表达的毕赤酵母工程菌:
4、(1)根据毕赤酵母的密码子偏好性，以人胶原蛋白ⅲ串联片段的氨基酸顺序为基础，利用毕赤酵母高频密码子对其进行优化，添加tga终止密码，全长1191bp，命名为396c,基因优化结果如seq no.3所示；
5、(2)将优化后的基因通过无缝合成，插入到毕赤酵母组成型分泌表达载体pgapzaa中；然后转化大肠杆菌，构建和筛选含有pgapza-396的阳性菌株；将线性化的pgapza-396cdna，转化入巴氏毕赤酵母sdm1168中，进行人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的表达，筛选得的巴氏毕赤酵母基因工程菌；
6、步骤二、对重组酵母进行高密度发酵培养，实现重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体高效表达；
7、步骤三、从发酵液中分离纯化重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体蛋白。
8、上述方案中重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体基于人ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域gly-x-y的三肽重复序列特征和强大的亲水性，选取人源胶原蛋白iii第981位氨基酸至1079氨基酸的99个氨基酸片段并串联4次，得到含396个氨基酸的结构，如seq no.2所示，单体分子量为46kda，三聚体分子量为138kda；人源胶原蛋白iii第981位氨基酸至1079氨基酸的99个氨基酸片段如seq no.1所示。
9、上述方案步骤二具体为：
10、采用高密度发酵技术，以ypd培养基为基础培养基，通过间接补料分批培养，以提高巴氏毕赤酵母基因工程菌株的细胞密度和蛋白质表达量；同时，种子培养基为ypd，三角瓶装载量为容量的1/5，培养条件为30℃230rmp，当od600＝1.3-1.5时4℃备用；发酵培养基配方为蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2.5％，泡敌0.02％，接种量为10％，最佳发酵条件为30℃、通气量为1.3-1.5vvm，罐压0.17-0.3mpa，搅拌转速300-350r/min，使溶氧>30％，流加体积分数为20％的氨水，使ph值维持在7.2～7.5；发酵18小时后，分别用20％的无菌葡萄糖、含有20％的蛋白胨和10％的酵母提取物的无菌混合液进行流加补料，流加时间为36小时，维持发酵液含1％葡萄糖浓度，当菌体质量浓度达320g/l、od600达300时放罐，发酵时间为60-62小时。
11、上述方案步骤三具体为：
12、将发酵液4℃、8000-10000g离心10分钟，取上清；搅拌中缓慢加入硫酸铵粉末，使溶液硫酸铵饱和度达到50％，然后4℃、9000-10000g离心15分钟，取沉淀，使用50％硫酸铵溶液洗涤沉淀一次，9000-10000g离心15分钟，沉淀用蒸馏水溶解沉淀后，4℃、9000-10000g离心15分钟，取上清；用sephadex g-50和溶液20mm tris-cl ph 7.5进行对上清液进行脱盐，收集280nm紫外检出峰溶液；再利用q seplife ff离子交换进行柱层析，20mm tris-clph 7.5缓冲液平衡柱体，上样后，使用ph 7.5、20mm tris-cl加1m nacl线性洗脱，收集20mmtris-cl加0.15m nacl的280nm紫外检出的洗脱峰；然后使用sephadex g-100凝胶柱层析分离纯化，pbs溶液洗脱，收集最大峰的液体即为目的蛋白，溶液经截留分子量30kda的超滤浓缩，再经冷冻干燥得到重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体。
13、上述方案重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体产量达到6-7g/l。
14、本专利技术具有以下有益效果：
15、1、本专利技术提供了一种利用重组毕赤酵母进行组成型、高效分泌表达重组人胶原蛋白ⅲ片段串联体的方法及其发酵和提取该重组胶原的技术，该重组人源胶原氨基酸结构和基因与目前所报道的不同，于甲醇诱导型毕赤酵母相比，该高密度发酵更简单易操作，发酵周期更短、所使用的培养基配方更简单和廉价，纯化提取方法更高效便捷。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于：所述重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y的三肽重复序列特征和强大的亲水性，选取人源胶原蛋白III第981位氨基酸至1079氨基酸的99个氨基酸片段并串联4次，得到含396个氨基酸的结构，如SEQ NO.2所示，单体分子量为46 kDa，三聚体分子量为138 kDa；人源胶原蛋白III第981位氨基酸至1079氨基酸的99个氨基酸片段如SEQ NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于：所述步骤二具体为：
4.根据权利要求3所述的重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于：所述步骤三具体为：
5.根据权利要求4所述的重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于：所述重组人源胶原蛋白Ⅲ片段串联体产量达到6-7g/L。
【技术特征摘要】
1.一种重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体的制备方法，其特征在于：所述重组人源胶原蛋白ⅲ片段串联体基于人ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域gly-x-y的三肽重复序列特征和强大的亲水性，选取人源胶原蛋白iii第981位氨基酸至1079氨基酸的99个氨基酸片段并串联4次，得到含396个氨基酸的结构，如seq no.2所示，单体分子量为46 kda，三聚体分子量为138 k...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭德军，惠琦，王志刚，时萍，
申请(专利权)人：西安昆创融源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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