【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种重组cntn2蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
1、接触蛋白2(contactin-2，cntn2)是免疫球蛋白细胞黏附分子(ig superfami lycell adhesion molecules，igcams)家族的一员，具有六个n端免疫球蛋白(ig)重复结构域、四个纤维连接蛋白iii(fniii)重复结构域、以及一个用于将其锚定在神经细胞膜上的c端糖基化磷脂酰肌醇(gpi)锚定结构。作为一种神经特异性糖蛋白，cntn2在轴突连接形成中起着关键作用，特别是对髓鞘轴突的完整性和功能具有重要影响。为进一步理解cntn2在神经元连接和信号传导中的具体作用机制，需要对cntn2的表达情况进行深入研究。
2、目前，现有研究主要采用原核表达系统或昆虫细胞表达系统来获取cntn2的部分结构域蛋白。其中，基于原核表达系统的方法是将编码cntn2部分结构域的目标基因插入质粒载体中，然后转化到大肠杆菌等原核生物中进行重组蛋白质的表达。这种方法能够快速且大规模地生产蛋白质，适合高通量实验需求。然而，原核表达系统缺乏天然的翻译后修饰机制，如磷酸化、糖基化、乙酰化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，可能导致表达的蛋白质在功能、稳定性、定位和免疫原性等方面与天然蛋白质存在差异。
3、基于昆虫细胞表达系统的方法是将目标基因插入到杆状病毒载体中，然后感染sf9、sf21或high5细胞等昆虫细胞，进而表达cntn2的部分结构域蛋白。该方法能够表达需要真核翻译后修饰的蛋白质，但昆虫细胞的培养条件复杂
技术实现思路
1、本专利技术通过构建哺乳动物细胞表达系统，提供一种重组cntn2蛋白及其制备方法和应用。
2、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种重组cntn2蛋白的制备方法，包括：s1、获取cntn2胞外段全长基因；s2、将所述cntn2胞外段全长基因连接到哺乳细胞分泌型表达载体上，构建重组载体；s3、利用所述重组载体瞬时转染哺乳动物细胞，构建重组细胞；和s4、利用所述重组细胞表达并获得所述重组cntn2蛋白。
4、在一些实施例中，所述步骤s1中，采用引物获取所述cntn2胞外段全长基因，所述引物包括，序列为seq id no:1的上游引物，和序列为seq id no:2的下游引物。
5、在一些实施例中，所述步骤s2中，所述哺乳细胞分泌型表达载体包括psect ag2b载体。
6、在一些实施例中，所述步骤s3中，所述哺乳动物细胞包括hek293f细胞。
7、在一些实施例中，所述步骤s3中，所述瞬时转染所采用的转染试剂包括聚乙烯亚胺。
8、在一些实施例中，所述步骤s4包括：s41、在培养基中培养所述重组细胞；s42、收集所述培养基的上清液；s43、采用镍-硝基三乙酸琼脂糖珠和咪唑洗脱缓冲液对所述上清液进行纯化；和s44、分离并获得所述重组cntn2蛋白。
9、在一些实施例中，所述步骤s43中，所述咪唑洗脱缓冲液包括体积比为(10-35):(100-350):(0.5-3.5):(100-500)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、氯化钠、二硫苏糖醇和咪唑。
10、在一些实施例中，所述步骤s44包括，采用体积比为(10-35):(100-350):(0.5-3.5)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、氯化钠和二硫苏糖醇进行凝胶过滤层析，获得所述重组cntn2蛋白。
11、本专利技术的第二方面，提供一种由上述重组cntn2蛋白的制备方法获得的重组cntn2蛋白。
12、本专利技术的第三方面，提供一种上述重组cntn2蛋白的制备方法在抗体制备中的应用。
13、本专利技术的有益效果是，
14、本专利技术利用哺乳动物细胞分泌型表达载体，并结合瞬时转染技术，在哺乳动物细胞表达系统中，实现了重组cntn2蛋白的高效、稳定和快速表达。这一方法不仅能够满足在真核生物中大量表达含有跨膜结构域的免疫蛋白的需求，而且在细胞培养过程中仅需使用少量无血清培养基，具有成本效益优势。
15、进一步地，对上述表达系统获得的产物进行进一步纯化，无需细胞破碎，只需收集细胞上清后，通过镍柱亲和分离即可获得目标蛋白，操作简便。此外，获得的重组cntn2蛋白具有高纯度和均一性，并展现出了高水平的折叠和稳定性，使得其接近天然状态。此外，该方法适用于cntn2蛋白的负染色以及冷冻电镜样品的检测和结构解析数据收集。
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1.一种重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用引物获取所述CNTN2胞外段全长基因，
3.根据权利要求1所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述哺乳细胞分泌型表达载体包括pSecTag2B载体。
4.根据权利要求1所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述哺乳动物细胞包括HEK293F细胞。
5.根据权利要求4所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述瞬时转染所采用的转染试剂包括聚乙烯亚胺。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S4包括：
7.根据权利要求6所述的重组CNTN2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S43中，所述咪唑洗脱缓冲液包括体积比为(10-35):(100-350):(0.5-3.5):(100-500)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、氯化钠、二硫苏糖醇和咪唑。
9.由权利要求1-5中任一项所述的重组CNTN2蛋白的制备方法获得的重组CNTN2蛋白。
10.权利要求9所述的重组CNTN2蛋白在抗体制备中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组cntn2蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的重组cntn2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，采用引物获取所述cntn2胞外段全长基因，
3.根据权利要求1所述的重组cntn2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述哺乳细胞分泌型表达载体包括psectag2b载体。
4.根据权利要求1所述的重组cntn2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述哺乳动物细胞包括hek293f细胞。
5.根据权利要求4所述的重组cntn2蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，所述瞬时转染所采用的转染试剂包括聚乙烯亚胺。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组cntn2蛋白的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：张珍珍，潘璠，李芳芳，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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