【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改良的的成熟多肽及其在合成人乳寡糖中的应用，属于基因和酶工程。
技术介绍
1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是一类独存于母乳中的天然寡糖混合物，也是母乳中的重要功能成分。研究发现，hmos对婴儿的肠道健康、免疫系统调节、身体生长、大脑认知发育起着重要作用。其中，乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)是母乳中含量最丰富的一种hmo，是中性的hmo的代表，化学式如式1。是其他长链hmo和许多糖脂共同的核心结构。乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)为lnt的同分异构体，化学式如式2所示。lnt和lnnt是母乳的重要成分，具有多种功能，二者在母乳中的比例差距较大，lnt的含量更高，为lnnt的8倍左右(craft km,townsend sd.synthesis of lacto-n-tetraose.carbohydr res.2017feb 22；440-441:43-50.)。
2、对于无法进行母乳喂养的婴幼儿，lnnt作为食品营养强化剂在儿童调制乳粉、婴儿配方食品、特殊医学用途配方食品中的用量0.2-0.6g/l(以纯品计，以即食状态计，粉状产品按冲调倍数增加使用量，2022年食品药品监督管理局征求意见稿)；乳酸-n-四糖作为婴儿配方奶粉lnt最高用量为1.82g/l(2023年欧盟批准，生产企业科汉森)，在这以前，批准的lnt用量在0.6-0.8g/l范围。因此，随着人们对hmos的认知提高和生产技术
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5、开发简便、高效、低成本且可大规模工业化生产hmos的方法，满足社会的需求，是hmos研究机构和企业在努力解决的事情。中国专利cn111534503a公开了合成乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法：以β-半乳糖苷酶催化乳糖-n-三糖和β-乳糖合成乳糖-n-新四糖；或者以几丁质酶、hahex74蛋白和β-半乳糖苷酶为生物酶，催化几丁质和β-乳糖合成乳糖-n-三糖ⅱ和乳糖-n-新四糖。
6、综上，为满足社会需求，需要对现有的hmos生产技术进行迭代，提供高效、且可规模化生产的技术是当务之急。
技术实现思路
1、专利技术目的：若能同时实现lnt和lnnt的高效、规模化生产，有利于乳制品、烘焙食品、饮料、膳食补充剂、特殊医学用途配方食品以及婴幼儿食品的快速配比和使用。本专利技术的目的在于提供具有较强催化合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳糖-n-新四糖(lnnt)活性的成熟多肽，以及利用它们催化合成lnt和lnnt。目前，尚没有检索到能同时合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳-n-新四糖(lnnt)的生物合成技术。
2、此外，本申请还提供了其相关核酸产品、酶产品及其制备方法和应用。
3、技术方案：
4、一种成熟多肽，为β-半乳糖苷酶wp_127489039.1，来源于neobacillus mesonae，其氨基酸序列如seq id no:1所示，实施例中，将其简称为d1，其具有催化合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳-n-新四糖(lnnt)活性。
5、所述β-半乳糖苷酶，是水解β-d-半乳糖苷键使d-半乳糖游离的酶，广泛存在于微生物和动植物中，其物种来源还可以是：米曲霉(aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxinus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)等，进一步优选的物种来源为环状芽胞杆菌(bacillus circulans)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)等。
6、申请人对如seq id no:1所示的糖苷水解酶进行了一系列改良，在保留合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳-n-新四糖(lnnt)活性的前提下，提高了合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳-n-新四糖(lnnt)的活性。
7、具体地，第一方面，本申请提供了如seq id no:1所示的氨基酸序列经过多个氨基酸残基的置换所形成的、具有如seq id no:1所示糖苷水解酶活性的氨基酸序列；其中，所述多个氨基酸残基的置换选自：氨基酸序列如seq id no:1所示成熟多肽中第182-189位，408-413位，449-454位，481-492、561-569位，571-573位、591-597、599-606位等位置的一个或多个氨基残基经置换后获得。
8、所述成熟多肽突变体，具有提高的催化合成lnt和lnnt活性。
9、所述修饰是指成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的dna的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸残基的置换和/或插入。
10、所述如seq id no:1所示成熟多肽中一个或几个氨基酸残基的修饰，优选的，选自如下突变方案中的一种或多种：
11、第182-185位的氨基酸残基由qpss置换为gmnc，第189位的氨基酸残基由s置换为t，第408-412位的氨基酸残基由qskkp置换为yghyq，称其为突变体d2，其氨基酸序列如seqid no:2所示；和/或
12、第408-413位的氨基酸残基由qskkpy置换为pmnrlt，第481-482位的氨基酸残基由ed置换为dn，第484-492位的氨基酸残基由trgdkvnvt置换为ikanwnesn，称其为突变体d3，其氨基酸序列如seq id no:3所示；和/或
13、第450-454位的氨基酸残基由ydttn置换为knket，第567-569位的氨基酸残基由dyv置换为slg，第571-573位的氨基酸残基由wgr置换位fak，称其为突变体d4，其氨基酸序列如seq id no:4所示；和/或
14、第182-184位的氨基酸残基由qps置换为rad，第189位的氨基酸残基由s置换为t，408-413位的氨基酸残基由qskkpy置换为pmnrlt，第593位的氨基酸残基由i置换为v，第600位的氨基酸残基由i置换为l，第606位的氨基酸残基由y置换为w，称其为突变体d5，其氨基酸序列如seq id no:5所示；和/或
15、第182-184位的氨基酸残基由qps置换为rad，第189位的氨基酸残基由s置换为t，408-413位的氨基酸残基由qskkpy置换为pmnrlt，449-453位的氨基酸残基由iydtt置换为sghga，第593位的氨基酸残基由i置换为v，第600位的氨基酸残基由i置换为l，第606位的氨基酸残本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有合成乳糖-N-四糖(LNT)和乳糖-N-新四糖(LNnT)活性的成熟多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.成熟多肽突变体，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示成熟多肽中的第182-189位，408-413位，449-454位，481-492、561-569位，571-573位、593、591-597、599-606位等位置的一个或多个氨基残基经修饰改造后获得，所述成熟多肽突变体，具有提高的催化合成LNT和LNnT活性；
3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-2任一项所述成熟多肽或成熟多肽突变体。
4.一种核酸构建体，其包含权利要求3所述多核苷酸，以及与之可操作地连接的一个或多个调控序列。
5.一种表达载体，其包含权利要求3所述多核苷酸，或者包含权利要求4所述核酸构建体。
6.一种转化的宿主细胞，含有转化了的权利要求4所述核酸构建体或权利要求5所述表达载体。
7.一种酶剂或酶组合物，其包含权利要求1所述的权利要求2所述成熟多肽突变体。
8.如权利要求1-2任一项所述成
9.权利要求1-2任一项所述成熟多肽或其突变体在合成LNT和LNnT方面的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种具有合成乳糖-n-四糖(lnt)和乳糖-n-新四糖(lnnt)活性的成熟多肽，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.成熟多肽突变体，其特征在于，如seq id no:1所示成熟多肽中的第182-189位，408-413位，449-454位，481-492、561-569位，571-573位、593、591-597、599-606位等位置的一个或多个氨基残基经修饰改造后获得，所述成熟多肽突变体，具有提高的催化合成lnt和lnnt活性；
3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-2任一项所述成熟多肽或成熟多肽突变体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：史梅娟，韩丽娟，方诩，李宾，
申请(专利权)人：山东恒鲁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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