【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测，具体涉及一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、诺如病毒又称诺瓦克病毒(norwalk viruses，nv)，为无包膜单股正链rna病毒，是继轮状病毒之后导致急性肠胃炎的第二种非细菌性肠道病原体。诺如病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低，感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短，且传播途径多样(可通过粪口途径在人与人之间传播)，全人群普遍易感，因此，诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力，可引起大面积或局部的流行。感染后会导致严重腹泻，引起胃痛、呕吐和恶心等。诺如病毒具有遗传多样性，诺如病毒分5个基因群(gⅰ-gⅴ)，其中只有gⅰ、gⅱ和gⅳ可以感染人，而gⅲ、gⅴ分别感染牛和鼠，我国目前最常见的诺如病毒为gⅰ、gⅱ型。
2、目前检测诺如病毒感染的主要方法包括主要有电镜法、rt-pcr、酶联免疫扩增杂交分析等。由于诺如病毒抗原的多样性，酶联免疫扩增杂交分析检测范围比较窄；电镜法设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，不适合大规模流行调查和临床研究。基于特定核酸片段扩增的pcr技术在病原体的快速、高灵敏度检测方面逐渐成为一项不可替代的手段，发挥着非常重要的作用，目前已经有很多针对单个病原体检测的pcr试剂广泛应用到医学实践中，但目前仍缺乏能够快速、准确、同时检测gⅰ、gⅱ分型检测诺如病毒亚型的试剂盒。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒及其检测方法，实现高效准确地检测gⅰ型和gⅱ型诺
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、本专利技术提供一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型的核酸检测试剂盒，包括：rt-pcr反应液、rt-pcr反应酶系和引物探针反应液；
4、所述引物探针反应液包括：
5、检测诺如病毒gⅰ型的第一引物的引物一g1-f：
6、cgytggatgcgcttycatga；
7、检测诺如病毒gⅰ型的第一引物的引物二g1-r：
8、cttagacgccatcatcattyac；
9、靶向诺如病毒gⅰ型的探针g1-p：tggacaggrgaycgc；
10、检测诺如病毒gⅱ型的第二引物对的引物一g2-f：
11、cargarbcnatgttyagrtggatgag；
12、检测诺如病毒gⅱ型的第二引物对的引物二g2-r：
13、tcgacgccatcttcattcaca；
14、靶向诺如病毒gⅱ型的探针g2-p：tgggagggcgatcgcaatct；
15、检测rnasep管家基因的第三引物对的引物一rp-f：
16、agatttggacctgcgagcg：
17、检测rnasep管家基因的第三引物对的引物二rp-r：
18、gagcggctgtctccacaagt；
19、靶向rnasep管家基因的探针rp-p：
20、ttctgacctgaaggctctgcgcg。
21、选取人源核糖核酸酶p(rnasep)作为内参基因，避免了假阳性的结果，对检测样本的采集，运输和提取过程进行监控。
22、进一步地，所述靶向诺如病毒gⅰ型的探针g1-p的5’端连接有荧光报告基团fam，3’端连接有猝灭基团mgb；
23、所述靶向诺如病毒gⅱ型的探针g2-p的5’端连接有荧光报告基团vic，3’端连接有猝灭基团bhq2；
24、所述靶向rnasep管家基因的探针rp-p的5’端连接有荧光报告基团cy5，3’端连接有猝灭基团bhq3。
25、进一步地，所述rt-pcr反应液的ph值为8.6-9.1；
26、所述rt-pcr反应液包括tris-hcl、kcl、mg2+和dntps；
27、所述dntps包括datp、dgtp、dutp、dttp和dctp；
28、所述rt-pcr反应液中各组分的浓度为：
29、tris-hcl：52mmo1/l；kcl：64mmo1/l；mg2+：5mmo1/l；dntps：0.3mmo1/l；
30、所述rt-pcr反应液中datp、dgtp和dctp的浓度相同；dttp和dutp的浓度比为1：2；datp浓度为dttp和dutp两者浓度之和。
31、进一步地，所述rt-pcr反应酶系包括ung酶、dna聚合酶和逆转录酶；
32、所述rt-pcr反应酶系中各组分的浓度为：
33、ung酶：0.05u/μl；dna聚合酶：0.35u/μl；逆转录酶：1.0u/μl。
34、进一步地，所述引物探针反应液中不同引物的浓度均为300nm；
35、所述引物探针反应液中不同探针的浓度为：
36、g1-p：200nm；g2-p：150nm；rp-p：100nm。
37、本专利技术还提供一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
38、步骤1、从粪便和呕吐物提取rna样本；
39、步骤2、按照所需检测样本个数配制反应液，将配制的反应液装至pcr管中，加入5μl样本后上机检测；
40、步骤3：根据样品ct值及扩增曲线分析判断得到检测结果。
41、进一步地，所述配制反应液的标准为：每个样本添加2份rt-pcr反应液、1份rt-pcr反应酶系和1份引物探针反应液。
42、进一步地，所述rt-pcr反应液的体积为12.5μl；
43、所述rt-pcr反应酶系的体积为1μl；
44、所述引物探针反应液的体积为6.5μl。
45、进一步地，所述上机检测的反应条件为：
46、第一阶段逆转录：反应温度为50℃，反应时间为20min；
47、第二阶段预变性：反应温度为95℃，反应时间为5min；
48、第三阶段循环反应：变性反应温度为95℃，变性反应时间为15s，退火温度为55℃，退火时间为30s，扩增40个循环；在第三阶段进行荧光信号采集。
49、进一步地，所述检测结果的分析判断方法为：
50、阴性对照无曲线扩增，且阳性对照fam、vic、cy5通道均有曲线扩增(ct≤30)，实验成立，否则视为结果无效；
51、若样品有s型扩增且ct值≤35则判定该通道反应阳性；
52、若ct值>38或未检出则判定该通道反应阴性；
53、若有s型扩增且35＜ct值≤38则为不确定样品，需重新提取核酸后再次检测。
54、本专利技术的有益效果：
55、本专利技术试剂盒能够有效检测诺如病毒gⅰ/gⅱ型，并且能对诺如病毒gⅰ/gⅱ型进行分型；所用引物的特异性强，各引物对之间没有交叉反应，与其它呼吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：RT-PCR反应液、RT-PCR反应酶系和引物探针反应液；
2.根据权利要求1所述的一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述靶向诺如病毒GⅠ型的探针G1-P的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有猝灭基团MGB；
3.根据权利要求1所述的一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液的pH值为8.6-9.1；
4.根据权利要求1所述的一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应酶系包括UNG酶、DNA聚合酶和逆转录酶；
5.根据权利要求1所述的一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述引物探针反应液中不同引物的浓度均为300nM；
6.一种如权利要求1-5任一项所述的诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种诺如病毒GⅠ/GⅡ型核酸检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述配制反应液的标准为：
<...【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：rt-pcr反应液、rt-pcr反应酶系和引物探针反应液；
2.根据权利要求1所述的一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述靶向诺如病毒gⅰ型的探针g1-p的5’端连接有荧光报告基团fam，3’端连接有猝灭基团mgb；
3.根据权利要求1所述的一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述rt-pcr反应液的ph值为8.6-9.1；
4.根据权利要求1所述的一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述rt-pcr反应酶系包括ung酶、dna聚合酶和逆转录酶；
5.根据权利要求1所述的一种诺如病毒gⅰ/gⅱ型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述引...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍佳茜，漆彩丽，陈奉玲，徐静，张超，
申请(专利权)人：安徽深蓝医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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