【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(cart)免疫疗法已显示出对b细胞恶性肿瘤(包括复发/难治性(r/r)淋巴瘤和白血病)患者临床结果的显著改善(lee,等人,the lancet(2015)385(9967):517-28；maude等人,new england journal of medicine(2018)378(5):439-48；park等人,new england journal of medicine(2018)378(5):449-59；schuster等人,newengland journal of medicine(2019)380(1):45-56；turtle等人,sciencetranslational medicine(2016)8(355):355ra116-355ra116)。尽管抗cd19 cart(cart19)的临床效果显著，但绝大多数接受目前批准的cart产品治疗的患者都失败于这些治疗。对这些试验中的急性淋巴细胞白血病(all)和慢性淋巴细胞白血病(cll)患者样品进行的分析揭示了对cart19疗法的反应程度与血液中car t的高水平扩增以及b细胞再生障碍的获得和维持有关。遗憾的是，患者对用于治疗实体瘤的car t细胞疗法的反应效果较差。针对实体瘤靶点的car t细胞通常不会在血液中遇到它们的关联靶点，而是在血液中进行有限的稳态car t细胞扩增，并被输送到肿瘤部位。到达肿瘤的car t细胞数量不足以消除疾病。此外，增加car t细胞的输注剂量已经揭示了靶点上肿瘤外(on-target
技术实现思路
1、本专利技术包括包含经修饰细胞的组合物和方法，例如用于治疗受试者中至少一种癌症体征和/或症状。经修饰细胞在受试者的外周血中扩增。还提供了相关的核酸、载体和药物组合物。
2、因此，在一个方面，本专利技术提供了一种分离核酸，其包含：
3、a.编码第一嵌合抗原受体(car)的第一核苷酸序列，第一car包含：
4、(i)对cd19具有亲和力的第一胞外抗原结合结构域，
5、(ii)第一跨膜结构域，和
6、(iii)包含至少一个共刺激结构域和信号传导结构域的第一胞内结构域；和
7、b.编码第二car的第二核苷酸序列，第二car包含：
8、(i)对肿瘤抗原具有亲和力的第二胞外抗原结合结构域，其中肿瘤抗原不是cd19，
9、(ii)第二跨膜结构域，和
10、(iii)包含至少一个共刺激结构域和信号传导结构域的第二胞内结构域。
11、在一些实施方式中，第一核苷酸序列位于第二核苷酸序列的5’。
12、在一些实施方式中，第一核苷酸序列位于第二核苷酸序列的3’。
13、在一些实施方式中，分离核酸进一步包含位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的接头核苷酸序列，其中接头核苷酸序列包含选自p2a、t2a、e2a和f2a的核糖体滑动序列(slip sequence)。
14、在一些实施方式中，分离核酸进一步包含与第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列可操作连接的启动子。
15、在一些实施方式中，启动子是ef1α启动子。
16、在一些实施方式中，分离核酸进一步包含转录后调控元件。
17、在一些实施方式中，转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调节元件(wpre)。
18、在一些实施方式中，肿瘤抗原选自甲胎蛋白(afp)/hla-a2、axl、b7-h3、bcma、ca-1x、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd70、cd79a、cd79b、cd80、cd86、cd117、cd123、cd133、cd147、cd171、cd276、cea、claudin 18.2、c-met、dll3、dr5、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、epcam、epha2、成纤维细胞活化蛋白(fap)、叶酸受体α(fra)/叶酸结合蛋白(fbp)、gd-2、糖脂f77、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)-连接的gdnf家族a-受体4(gfrα4；gfralpha4)、her2、hla-a2、icam1、白细胞介素13受体亚基α(il3rα)、白细胞介素13受体亚基α1(il13rα1)、白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)、lage-1、lewis y、lmp1(ebv)、mage-a1、mage-a3、mage-a4、melan a、间皮素、mg7(糖基化cea)、mmp、muc1、nectin4/fap、nkg2d-配体(mic-a、mic-b和ulbp 1至6)、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、p16、pd-l1、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、ror1、ror2、tim-3、tm4sf1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、vegfr2及其任意组合。
19、在某些实施方式中，肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(psma)、muc1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)-连接的gdnf家族a-受体4(gfrα4；gfralpha4)、叶酸受体α(frα)、间皮素、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、前列腺干细胞抗原(psca)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、表皮生长因子受体(egfr)、白细胞介素13受体亚基α1(il13rα1)和白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)。
20、在某些实施方式中，第一胞外抗原结合结构域和第二胞外抗原结合结构域各自独立地选自单链可变片段(scfv)和fab。
21、在某些实施方式中，第一或第二胞内结构域的至少一个共刺激结构域包括独立选自4-1bb、cd2、cd28和icos的蛋白质的共刺激结构域。
22、在某些实施方式中，信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域。
23、在某些实施方式中，第一和/或第二跨膜结构域包括独立选自cd8、cd28和4-1bb的蛋白质的跨膜结构域。
24、在某些实施方式中，第一和/或第二car进一步包含铰链结构域。
25、在某些实施方式中，铰链结构域包括cd8铰链结构域。
26、在某些实施方式中，本专利技术提供了本文公开的分离核酸，其中
27、a.第一car包含：
28、(i)包含抗cd19 scfv的第一胞外抗原结合结构域，
29、(ii)第一跨膜结构域，和
30、(iii)包含cd28共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域的第一胞内结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分离核酸，其包含：
2.根据权利要求1所述的分离核酸，其中所述第一核苷酸序列位于所述第二核苷酸序列的5’处，或其中所述第一核苷酸序列位于所述第二核苷酸序列的3’处。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离核酸，其进一步包含位于所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列之间的接头核苷酸序列，其中所述接头核苷酸序列包括选自P2A、T2A、E2A和F2A的核糖体滑动序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含与所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列可操作连接的启动子。
5.根据权利要求4所述的分离核酸，其中所述启动子是EF1α启动子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含转录后调控元件。
7.根据权利要求6所述的分离核酸，其中所述转录后调控元件是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(WPRE)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-1X、CD2、CD3、C
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(PSMA)、MUC1、MUC1的Tn-糖型(TnMUC1)、糖基-磷脂酰肌醇(GPI)-连接的GDNF家族a-受体4(GFRα4；GFRalpha4)、叶酸受体α(FRα)、间皮素、纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、表皮生长因子受体(EGFR)、白细胞介素13受体亚基α1(IL13Rα1)和白细胞介素13受体亚基α2(IL13Rα2)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述第一胞外抗原结合结构域和所述第二胞外抗原结合结构域各自独立地选自单链可变片段(scFv)和Fab。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述第一胞内结构域或所述第二胞内结构域的所述至少一个共刺激结构域包括独立选自4-1BB、CD2、CD28和ICOS的蛋白质的共刺激结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中第一和/或第二跨膜结构域包括独立选自CD8、CD28和4-1BB的蛋白质的跨膜结构域。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中第一和/或第二CAR进一步包括铰链结构域。
15.根据权利要求14所述的分离核酸，其中所述铰链结构域包括CD8铰链结构域。
16.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中：
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中：
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含编码开关受体的第三核苷酸序列，其中所述开关受体包含第一受体的胞外结构域和第二受体的胞内结构域，其中所述第一受体和所述第二受体分别选自TGFβR和IL12R、TGF...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种分离核酸，其包含：
2.根据权利要求1所述的分离核酸，其中所述第一核苷酸序列位于所述第二核苷酸序列的5’处，或其中所述第一核苷酸序列位于所述第二核苷酸序列的3’处。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离核酸，其进一步包含位于所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列之间的接头核苷酸序列，其中所述接头核苷酸序列包括选自p2a、t2a、e2a和f2a的核糖体滑动序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含与所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列可操作连接的启动子。
5.根据权利要求4所述的分离核酸，其中所述启动子是ef1α启动子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含转录后调控元件。
7.根据权利要求6所述的分离核酸，其中所述转录后调控元件是土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(afp)/hla-a2、axl、b7-h3、bcma、ca-1x、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd70、cd79a、cd79b、cd80、cd86、cd117、cd123、cd133、cd147、cd171、cd276、cea、claudin 18.2、c-met、dll3、dr5、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、epcam、epha2、成纤维细胞活化蛋白(fap)、叶酸受体α(fra)/叶酸结合蛋白(fbp)、gd-2、糖脂f77、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)连接的gdnf家族a-受体4(gfrα4；gfralpha4)、her2、hla-a2、icam1、白细胞介素13受体亚基α(il3rα)、白细胞介素13受体亚基α1(il13rα1)、白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)、lage-1、lewis y、lmp1(ebv)、mage-a1、mage-a3、mage-a4、melan a、间皮素、mg7(糖基化cea)、mmp、muc1、nectin4/fap、nkg2d-配体(mic-a、mic-b和ulbp 1至6)、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、p16、pd-l1、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、ror1、ror2、tim-3、tm4sf1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、vegfr2及其任意组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(psma)、muc1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)-连接的gdnf家族a-受体4(gfrα4；gfralpha4)、叶酸受体α(frα)、间皮素、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、前列腺干细胞抗原(psca)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、表皮生长因子受体(egfr)、白细胞介素13受体亚基α1(il13rα1)和白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述第一胞外抗原结合结构域和所述第二胞外抗原结合结构域各自独立地选自单链可变片段(scfv)和fab。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述第一胞内结构域或所述第二胞内结构域的所述至少一个共刺激结构域包括独立选自4-1bb、cd2、cd28和icos的蛋白质的共刺激结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中所述信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中第一和/或第二跨膜结构域包括独立选自cd8、cd28和4-1bb的蛋白质的跨膜结构域。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中第一和/或第二car进一步包括铰链结构域。
15.根据权利要求14所述的分离核酸，其中所述铰链结构域包括cd8铰链结构域。
16.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中：
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其中：
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含编码开关受体的第三核苷酸序列，其中所述开关受体包含第一受体的胞外结构域和第二受体的胞内结构域，其中所述第一受体和所述第二受体分别选自tgfβr和il12r、tgfβr和cd28、tgfβr和ox40、tgfβr和cd27、tgfβr和4-1bb、tgfβr和il-2r、tgfβr和il-9r、pd1和il12r、pd1和cd28、pd1和icos、pd1和cd27、pd1和4-1bb、pd1和il-2r、pd1和il-9r、btla和cd28、btla和icos、btla和cd27、ctla4和cd28、tim3和il12r、tim3和cd28、tim3和cd28、tim3和ox40、tim3和4-1bb、tim3和il-2r、tim3和il-9r、vsig3和cd28、vsig3-il12rβ2、vsig3和cd27、vsig3和4-1bb、vsig3和icos、vsig3-il12rβ1、vsig8-il12rβ1、vsig8和cd28、vsig8-il12rβ2、vsig8和cd27、vsig8和4-1bb、vsig8-icos、vista和il-9r、tigit和il-9r、ifny和cd28、ifny和ox40、ifny和il2r以及ifny和il12r。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离核酸，其进一步包含编码显性阴性受体的第四核苷酸序列，其中所述显性阴性受体是dntgfβr。
20.一种包含前述权利要求中任一项所述的分离核酸的载体。
21.根据权利要求26所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。
22.一种经修饰细胞，其包含权利要求1-19中任一项所述的分离核酸或权利要求20-21中任一项所述的载体。
23.根据权利要求22所述的经修饰细胞，其中所述细胞选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。
24.根据权利要求23所述的经修饰细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞或人类细胞，并且进一步其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞。
25.根据权利要求24所述的经修饰细胞，其中所述免疫细胞是t细胞。
26.一种经修饰细胞，其中所述细胞是免疫细胞或其前体细胞，并且其中所述细胞被工程化为表达：
27.根据权利要求26所述的经修饰细胞，其中所述肿瘤抗原选自甲胎蛋白(afp)/hla-a2、axl、b7-h3、bcma、ca-1x、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd70、cd79a、cd79b、cd80、cd86、cd117、cd123、cd133、cd147、cd171、cd276、cea、claudin 18.2、c-met、dll3、dr5、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、epcam、epha2、成纤维细胞活化蛋白(fap)、叶酸受体α(fra)/叶酸结合蛋白(fbp)、gd-2、糖脂f77、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、her2、hla-a2、icam1、白细胞介素13受体亚基α(il3rα)、白细胞介素13受体亚基α1(il13rα1)、白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)、lage-1、lewis y、lmp1(ebv)、mage-a1、mage-a3、mage-a4、melan a、间皮素、mg7(糖基化cea)、mmp、muc1、nectin4/fap、nkg2d-配体(mic-a、mic-b和ulbp 1至6)、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、p16、pd-l1、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、ror1、ror2、tim-3、tm4sf1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)连接的gdnf家族α-受体4(gfrα4；gfralpha4)、vegfr2及其任意组合。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的经修饰细胞，其中所述肿瘤抗原选自前列腺特异性膜抗原(psma)、muc1、muc1的tn-糖型(tnmuc1)、叶酸受体α(frα)、间皮素、纽约食管鳞状细胞癌-1(ny-eso-1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(gpc2)、糖基-磷脂酰肌醇(gpi)连接的gdnf家族α-受体4(gfrα4；gfralpha4)、前列腺干细胞抗原(psca)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、表皮生长因子受体(egfr)和白细胞介素13受体亚基α2(il13rα2)。
29.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中所述第一胞外抗原结合结构域和所述第二胞外抗原结合结构域各自独立地选自单链可变片段(scfv)和fab。
30.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中所述第一胞内结构域或所述第二胞内结构域的至少一个共刺激结构域包括独立选自4-1bb、cd2、cd28和icos的蛋白质的共刺激结构域。
31.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中所述信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域。
32.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中第一和/或第二跨膜结构域包括独立选自cd8、cd28和4-1bb的蛋白质的跨膜结构域。
33.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中第一和/或第二car进一步包含铰链结构域。
34.根据权利要求33所述的经修饰细胞，其中所述铰链结构域包含cd8铰链结构域。
35.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中：
36.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中：
37.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰细胞，其中所述细胞被进一步工程化为表达开关受体，其中所述开关受体包括第一受体的胞外结构域和第二受体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·H·祝恩，R·M·杨，Z·王，M·西乌拉，A·芬克，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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