【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及基因工程，具体涉及一种高卢蜜环菌溶质结合蛋白基因agsbp6在影响蜜环菌生长能力中的应用。
技术介绍
1、高卢蜜环菌(armillaria gallica)是一类广泛分布于北半球温带地区的寄生性真菌，主要以寄生和腐解植物为生，对多种乔木和灌木都具有较强的侵染能力。蜜环菌对植物造成的危害主要表现为根部腐朽和组织坏死，导致植物生长受阻、叶片枯萎、甚至死亡。蜜环菌虽然被认为是一种病原真菌，但在1911年s kusano首次发现并报道蜜环菌和天麻的共生关系，发现蜜环菌能和天麻共生从而促进天麻生长，从而走进大众的视野。天麻在生长过程中自身不能提供足够的营养来供其生长，所以通过和蜜环菌共生来实现生长。天麻的整个生活史都和蜜环菌密切相关，生长的天麻通过消化吸收侵入天麻体内的蜜环菌的菌索来获取生长发育所需的营养物质。所以蜜环菌菌种的质量会影响天麻的产量和质量，通过基因工程的方法改造培养出一株优良的蜜环菌菌种对于提高天麻的产量和质量有重要意义。
2、溶质结合蛋白(solute binding proteins，sbps)是一类在微生物中广泛存在的蛋白质，它们参与了细菌和真菌等微生物对外界环境中营养物质的感知和吸收。在细菌体内鉴别了至少33个sbps蛋白pfam家族，sbps家族成员可以识别的配体类型，包括氨基酸和有机酸、嘌呤、金属离子、含氧阴离子、维生素、群体感应信号和不同的铁载体，这些物质贯穿着生物的生长。在这些家族中，每个家族分别和不同的底物结合，从而为abc转运蛋白不断提供底物。在sbps的超家族中，有
3、目前还未见高卢蜜环菌溶质结合蛋白基因agsbp6在提高蜜环菌生长能力中的应用。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种高卢蜜环菌溶质结合蛋白基因agsbp6及其新用途，溶质结合蛋白基因agsbp6的核苷酸序列如seq id no:1所示，编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
2、本专利技术另一目的是将上述溶质结合蛋白基因agsbp6应用在促进蜜环菌生长中。
3、本专利技术采用如下技术方案实现本专利技术目的：
4、1、高卢蜜环菌的培养
5、①将高卢蜜环菌菌索取出置于pda平板(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、ddh2o 1l，ph自然，115℃灭菌20min)上，25℃培养8天；
6、②挑取pda培养基上长出的菌丝于液体完全培养基(葡萄糖46g、酵母膏5g、蛋白胨13g、硫酸镁2g、磷酸二氢钾1g、ddh2o 1l，ph 6.5，115℃灭菌20min)中，在25℃、150rpm下避光培养10天，长出菌丝体备用；
7、2、从用naa处理蜜环菌菌丝体5h和10h后的转录组数据中筛选出log2(变化倍数)>2的差异表达基因agsbp6；从转录组数据中筛选得到的agsbp6基因的cds，通过snapgene软件设计agsbp6基因的pcr引物。在smart数据库(smart:sequence analysis results(embl.de))中，对agsbp6蛋白序列进行分析，以确定agsbp6蛋白序列具有sbp_bac_6蛋白结构域，预测结果显示在agsbp6蛋白序列的第144至357个氨基酸序列之间编码的是sbp_bac_6结构域，agsbp6基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。取高卢蜜环菌菌丝，采用trizol reagent(invitrogen)法提取高卢蜜环菌总rna，rna反转录获得cdna。
8、3、构建agsbp6基因抑制表达载体和过表达载体
9、以cdna为模板，采用agsbp6-f和agsbp6-r引物克隆agsbp6基因，胶回收后连接到pmd-18t载体上，转入大肠杆菌dh5α中，测序以验证所获得的agsbp6基因是否正确；
10、按照gateway技术，对t-a克隆获得的pmd18t-agsbp6载体和pentr2b载体使用ecorⅰ和xhoⅰ进行双酶切，使用dna胶回收试剂盒回收目的片段，将agsbp6基因片段连接至pentr2b载体上，构建获得pentr-agsbp6入门载体；
11、使用gateway lr clonasetmⅱenzyme mix试剂盒，对pentr-agsbp6入门载体与载体pk7gwiwg2进行lr反应，构建抑制表达载体pk-35s-agsbp6-i-agsbp6；
12、使用gateway lr clonasetmⅱenzyme mix试剂盒，对pentr-agsbp6入门载体与载体ph2gw7,0进行lr反应，构建agsbp6基因过表达载体ph-35s-agsbp6。
13、4、游离氨基酸测定
14、参考“云南省部分兰科植物中总氨基酸的含量测定”和“茚三酮比色法测定秋葵中氨基酸含量条件的优化”中的方法测定a.gallica野生型和转基因菌株中的游离氨基酸含量，配置2％的茚三酮溶液，称取新鲜的菌索样品0.5g，置于研钵中，加入液氮冷冻后研磨至粉末，加入2ml 65％的乙醇继续研磨充分，再次加入65％的乙醇至30ml，用滤纸过滤，将滤液定容至50ml，冷藏备用；同时按照“云南省部分兰科植物中总氨基酸的含量测定”中的方法绘制标准曲线，测定并计算样品中游离氨基酸的含量。
15、5、agsbp6基因植物表达载体构建和亚细胞定位以cdna为模板，采用agsbp6-f1和agsbp6-r1引物扩增agsbp6基因，使用clonexpressⅱone step cloning kit试剂盒，利用同源重组的方法将agsbp6基因连接到植物表达载体pcambia-35s-gfp上，构建获得植物表达载体pcambia-agsbp6-gfp。
16、为了研究agsbp6蛋白的亚细胞定位，将构建好pcambia-ags本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶质结合蛋白基因AgSBP6，其来源于高卢蜜环菌，所述溶质结合蛋白基因AgSBP6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的溶质结合蛋白基因AgSBP6在促进高卢蜜环菌生长中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种溶质结合蛋白基因agsbp6，其来源于高卢蜜环菌，所述溶质结合蛋白基因agsbp6的核苷酸序列如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，李文超，胥鹏，赵星，周泽仪，黄元冲，年洪娟，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。