【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗制备，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗。
技术介绍
1、1970年第一次检测出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)。该病一年四季均可发生，但冬季多发。pedv仅感染猪，且各个年龄段的猪均易感，潜伏期一般2～4天，最短仅12h。常以暴发性腹泻的形式出现，仔猪感染后症状最严重，一般在出现腹泻后的2～4天内脱水死亡。
2、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus)主要感染仔猪，表现出呕吐、腹泻、脱水等临床症状，空肠、回肠肠绒毛出现萎缩、变短、脱落。pdcov具有全球流行的趋势，给养猪业造成巨大损失。
3、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis ofswine，tge)由冠状病毒科的tgev引发，是一种急性、高度接触性的肠道传染病。不同年龄的猪感染后的表现有所差异。对于10日龄以内的仔猪，感染后往往在24h内出现呕吐，随后出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色并含有未消化的凝乳块。这些仔猪体重迅速下降，脱水症状明显，通常在发病后的2～7天内死亡，死亡率高达100％。
4、截止目前，我国现有的pedv和tgev防控疫苗主要是以灭活疫苗和弱毒疫苗为主，pdcov未有商品化疫苗，能够实现同时预防pedv、tgev及pdcov的三联亚单位疫苗制作方法还未见报道。
技术实现思路
1、本
2、本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗，所述三联亚单位疫苗包括抗原和免疫佐剂；所述抗原包括猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白。
3、优选的是，编码猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白的基因经杆状病毒密码子偏爱性优化后核苷酸序列分别为seq idno.1、seq id no.2和seq id no.3。
4、优选的是，所述三联亚单位疫苗中猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白的质量比为(2～4)：(2～4)：(2～4)。
5、优选的是，每剂所述三联亚单位疫苗中，猪流行性腹泻病毒scoe蛋白的用量为20～40μg，猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白大的用量为20～40μg，猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白的用量为20～40μg。
6、优选的是，所述免疫佐剂包括isa201 vg佐剂和cpg 2395免疫增强剂。
7、优选的是，isa201 vg佐剂与抗原的质量比为1:1；cpg 2395免疫增强剂添加的体积百分含量为5％。
8、优选的是，所述三联亚单位疫苗的ph值为7.6～8.2。
9、本专利技术还提供了上述技术方案所述三联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
10、无菌条件下，将抗原和免疫佐剂混合，得到三联亚单位疫苗。
11、优选的是，所述抗原的制备方法包括以下步骤：
12、将经杆状病毒密码子偏爱性优化后的抗原的基因序列分别克隆到杆状病毒转移载体，得到重组杆状病毒载体pfastbachta-coe、pfastbachta-rbd和pfastbachta-sad；
13、将所述重组杆状病毒载体pfastbachta-coe、pfastbachta-rbd和pfastbachta-sad分别转入感受态细胞dh10bac中、培养，筛选，提取得到重组穿梭杆粒bacmid-coe、bacmid-rbd和bacmid-sad；
14、将重组穿梭杆粒bacmid-coe、bacmid-rbd和bacmid-sad分别转染至sf9细胞中，拯救出重组杆状病毒ac mnpv-coe、ac mnpv-rbd和ac mnpv-sad；
15、将重组杆状病毒ac mnpv-coe、ac mnpv-rbd和ac mnpv-sad分别接毒至hi-five细胞中，将细胞进行超声波破碎处理，离心取上清液，经离子交换层析法得到抗原pedv-scoe蛋白、pdcov-srbd蛋白和tgev-sad蛋白。
16、优选的是，所述免疫佐剂包括isa201 vg佐剂和cpg 2395免疫增强剂，isa201 vg佐剂与抗原的质量比为1:1；cpg 2395免疫增强剂添加的体积百分含量为5％。
17、本专利技术提供了一种猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗。目前未有猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗。本专利技术使用安全、高效的昆虫-杆状病毒真核表达系统，且通过人工密码子优化有效提高蛋白表达水平，得到的重组蛋白结构状态与天然结构状态完全一致，最大程度的保留了蛋白的功能和免疫原性。本专利技术所述三联亚单位疫苗成分简单，安全，抗病毒种类多，免疫效果好。
18、本专利技术所制备的猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗与单苗相比，可减少人工成本、减少疫苗免疫接种次数，简化繁杂的免疫程序，降低因免疫产生的应激性反应，显著减少生产成本，避免了毒素外泄，毒力返强，灭活不彻底等一系列安全隐患。试验结果表明，本专利技术的pedv、pdcov、tgev三联亚单位疫苗通过免疫小鼠能够在小鼠体内产生显著的免疫效果。
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1.一种猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗，其特征在于，所述三联亚单位疫苗包括抗原和免疫佐剂；所述抗原包括猪流行性腹泻病毒SCOE蛋白、猪德尔塔冠状病毒SRBD蛋白和猪传染性胃肠炎病毒SAD蛋白。
2.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，编码猪流行性腹泻病毒SCOE蛋白、猪德尔塔冠状病毒SRBD蛋白和猪传染性胃肠炎病毒SAD蛋白的基因经杆状病毒密码子偏爱性优化后核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，所述三联亚单位疫苗中猪流行性腹泻病毒SCOE蛋白、猪德尔塔冠状病毒SRBD蛋白和猪传染性胃肠炎病毒SAD蛋白的质量比为(2～4)：(2～4)：(2～4)。
4.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，每剂所述三联亚单位疫苗中，猪流行性腹泻病毒SCOE蛋白的用量为20～40μg，猪德尔塔冠状病毒SRBD蛋白大的用量为20～40μg，猪传染性胃肠炎病毒SAD蛋白的用量为20～40μg。
6.根据权利要求5所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，ISA201 VG佐剂与抗原的质量比为1:1；CPG 2395免疫增强剂添加的体积百分含量为5％。
7.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，所述三联亚单位疫苗的pH值为7.6～8.2。
8.权利要求1～7任一项所述三联亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抗原的制备方法包括以下步骤：
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述免疫佐剂包括ISA 201VG佐剂和CPG 2395免疫增强剂，ISA201 VG佐剂与抗原的质量比为1:1；CPG 2395免疫增强剂添加的体积百分含量为5％。
...【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒三联亚单位疫苗，其特征在于，所述三联亚单位疫苗包括抗原和免疫佐剂；所述抗原包括猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白。
2.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，编码猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白的基因经杆状病毒密码子偏爱性优化后核苷酸序列分别为seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3。
3.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，所述三联亚单位疫苗中猪流行性腹泻病毒scoe蛋白、猪德尔塔冠状病毒srbd蛋白和猪传染性胃肠炎病毒sad蛋白的质量比为(2～4)：(2～4)：(2～4)。
4.根据权利要求1所述的三联亚单位疫苗，其特征在于，每剂所述三联亚单位疫苗中，猪流行性腹泻病毒scoe蛋白的用量为20～40μg，猪德尔塔冠状病毒srb...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑兰兰，魏战勇，贾鑫浩，王年祥，张红垒，马世杰，马梦瑶，刘航，钱梦薇，孙寅贺，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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