【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原微生物快速检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系、检测试剂盒、检测方法及其应用。
技术介绍
1、人腺病毒(human adenovirus，hadv)是一种无包膜双链dna病毒，主要引起呼吸道疾病，也可感染消化道、泌尿道、眼部而引起疾病，其致病性、临床症状与其型别密切相关。依据生物学特性的不同，国际病毒学分类委员会(ictv)划分为a～g共7个亚属。a、f和g主要引起消化道感染、腹泻，c、e和部分b亚属主要引起呼吸道疾病，其他b亚属主要引起尿路感染，d亚属主要引起角膜炎和结膜炎。人腺病毒可导致多种人类疾病，其中与呼吸道疾病相关的人腺病毒主要有b亚属(hadv-3、7、11、14、16、21、50、55)，c亚属(hadv-1、2、5、6、57)和e亚属(hadv-4)。而引起常见呼吸道疾病的b亚属主要为hadv-3、7、11、14和55。报道显示hadv感染人群主要集中3～6岁，中位年龄为4岁6月。5岁以下儿童占58.73％。学龄前儿童检出率最高，其次是婴幼儿和学龄儿童，传播途径主要是经空气飞沫传播。因此，准确鉴定和区分人腺病毒对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。
2、人腺病毒为dna病毒，人腺病毒7型hadv-7属于其7个亚群中的b群，是全球范围内引起急性呼吸道感染的常见病原体，由hadv-7所引起的感染可占到全部人腺病毒感染的约20％且较为严重。hadv-7感染者是其主要的传染源，主要通过飞沫传播，感染者通过咳嗽、喷嚏等形式排出的呼吸道
3、近年来发展的规律间断成簇短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)技术因其卓越的检测机制、快速的反应效率、优异的检测灵敏度、简易的外部反应条件而被广泛的应用于现场即时检测(point-of-care testing,poct)。成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced shortpalindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein,cas蛋白)组成的crispr-cas系统是细菌或古细菌体内的一种获得性免疫系统。crispr-cas系统不仅可用于基因编辑，也可用于病原体的核酸检测。cas12a蛋白具有反式切割活性，cas12a蛋白在crrna的引导下特异性地与靶向双链dna(dsdna)结合并激活其反式切割活性，不加区别的切割非特异性单链dna(ssdna)，通过在ssdna两端修饰荧光基团和猝灭基团，当ssdna探针裂解后会发出荧光信号，因此crispr-cas12a系统可作为核酸检测的工具。
4、重组酶聚合反应(rpa)是一种等温扩增策略，通过使用重组酶分离dsdna靶标，并催化引物与同源模板序列的杂交，从而引发同源位点的链交换。所得到的结构通过ssdna结合蛋白来稳定，以防止分支迁移引起的引物移位。随后，dna聚合酶识别重组酶分解留下的引物3’端，并启动引物延伸反应。该过程的循环重复导致目标序列的指数放大。在40分钟内，数百万个目标拷贝在低温(37-42℃)下积累，检测极限低至单个目标拷贝。除了其他等温技术中使用的检测方法外，rpa可以和基于fret的荧光探针和横向流动条带传感系统结合，分别降低了背景噪声和实现无仪器的结果显示，用于检测病原体和病毒。rpa属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，无需精密仪器，具有反应迅速、灵敏度高、特异性强、低温运行、适用性广、试剂形态灵活和检测形式多样等优势，可成为传统pcr方法的替代品。
5、公开号为cn113355324a，申请日为2021年7月13日的中国专利公开了一种用于人腺病毒7型检测的探针、试剂盒及其使用方法，该试剂盒为基于mira荧光法的人腺病毒7型核酸检测试剂盒，其中，mira的引物是根据腺病毒7型hexon基因特异序列而设计，但是此专利技术所扩增的人腺病毒7型hexon基因保守序列为现有技术所知的序列，未提供设计新型人腺病毒7型crrna进行检测的技术启示；公开号为cn113502351a，申请日为2021年6月29日的中国专利公开了一种crrna及用于crispr-cas12a检测人腺病毒核酸的方法，所述crispr-cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，并且由于结合了pcr扩增技术时，即pcr-cas12a检测技术放大了pcr核酸扩增信号，所述检测方法具有极高的检测灵敏度，但是该检测方法的灵敏度主要针对的是主要流行的人腺病毒b亚群，对于b亚群中3、7、14、55型人腺病毒无法做出准确的区分。
6、因此，基于crispr-cas12a系统的高灵敏、高特异核酸检测技术将在病原体诊断领域发挥巨大作用，设计一种针对b亚群中7型人腺病毒的高敏感、高特异pcr-cas12a核酸检测技术，为人呼吸道腺病毒的检测和监测提供新方法，具有重要的应用潜力和研究意义。
技术实现思路
1、为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系、检测试剂盒、检测方法及其应用，所述检测体系和检测方法操作简易，且对于人腺病毒7型具有高灵敏度、高特异性的特点。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的目的之一在于提供一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系，所述检测体系包括cas12a-crrna功能性复合物、用于扩增人腺病毒7型特异性序列的rpa引物对和探针；
4、所述cas12a-crrna功能性组合物由crrna与cas12a结合而形成，所述crrna的核苷酸序列为seq id no:1。
5、进一步地，所述rpa上游引物为核苷酸序列是seq id no:2的单链dna分子，所述rpa下游引物为核苷酸序列是seq id no:3的单链dna分子。
6、进一步地，所述探针为荧光基团和淬灭基团双标记的单链dna探针或荧光基团和生物素双标记的单链dna探针。
7、进一步地，所述荧光基团和淬灭基团双标记的单链dna探针的5’端标记荧光基团fam，3’端标记淬灭基团bhq1；所述探针的核苷酸序列如seq id no:4所示；
8、所述荧光基团和生物素双标记的单链dna探针的5’端标记荧光基团
9、fam，3’端标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述检测体系包括Cas12a-crRNA功能性复合物、用于扩增人腺病毒7型特异性序列的RPA引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述探针为荧光基团和淬灭基团双标记的单链DNA探针或荧光基团和生物素双标记的单链DNA探针。
4.根据权利要求3所述的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团双标记的单链DNA探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
5.一种如权利要求1-4任一项所述基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种基于RPA-CRISPR/C
7.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述人腺病毒7型检测体系、病毒裂解试剂、用于RPA反应的组分以及用于crRNA转录的组分。
8.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测方法，其特征在于，所述检测方法基于非诊断目的，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测方法，其特征在于，
10.一种如权利要求8或9所述基于RPA-CRISPR/Cas12a的人腺病毒7型检测方法在基于非诊断目的检测或鉴定人腺病毒7型中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述检测体系包括cas12a-crrna功能性复合物、用于扩增人腺病毒7型特异性序列的rpa引物对和探针；
2.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述探针为荧光基团和淬灭基团双标记的单链dna探针或荧光基团和生物素双标记的单链dna探针。
4.根据权利要求3所述的一种基于rpa-crispr/cas12a的人腺病毒7型检测体系，其特征在于，所述荧光基团和淬灭基团双标记的单链dna探针的5’端标记荧光基团fam，3’端标记淬灭基团bhq1；所述探针的核苷酸序列如seq id no:4所示；
5.一种如权利要求1-4任一项所述基于rpa-crisp...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭绍彬，冯相壹，郑舒婷，焦佳彦，施明鸿，石贤爱，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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