【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和分子育种领域，具体涉及一种与梨果实早熟相关的分子标记、扩增引物及其应用。
技术介绍
0、技术背景
1、梨是我国重要经济果树之一，已在全世界87个国家大面积栽植，其果实营养价值很高，果肉脆嫩汁多，风味优美，深受广大消费者喜爱。近年来，早熟梨果实因能够抢占市场先机、满足人们对鲜果消费的需求，具有极为广阔的市场前景，越发受到重视，因此早熟梨的育种工作是一项非常重要的目标。
2、梨树为多年生落叶果树，童期较长，常规育种时间较长，且梨基因组杂合度较高(wu et al.,2013)，性状遗传和表型复杂多变，受环境影响较大。近些年高通量测序技术快速发展，果树上高效利用分子标记，构建高密度的遗传图谱，更加全面的发掘农艺性状相关的qtl位点，开发分子标记成为重点研究方向之一。
3、目前早熟梨的种质匮乏，针对梨果实成熟期的研究较少，梨早熟相关的snp分子标记的开发和应用尚未报道。因此，开展梨果实成熟期的研究，开发梨果实早熟相关的snp分子标记有利于掌握和调控梨果实成熟进程，提高梨果实品质，加快早熟梨的育种进程，满足消费者多样性需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种与梨果实早熟相关的snp位点fm_22516479及其应用。本专利技术根据qtl的定位结果，开发基于高分辨率熔解曲线鉴定的梨早熟相关的snp分子标记fm_22516479及其扩增引物和应用。采用该分子标记能够在dna水平上对分离群体的成熟期进行早期的鉴定和筛选，为实
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术请求保护检测snp位点fm_22516479多态性或基因型的物质在下述任一项中的应用：
4、(a1)在鉴定或辅助鉴定梨品种早熟时期中的应用；
5、(a2)在制备用于鉴定或辅助鉴定梨品种早熟时期的产品中的应用；
6、(a3)在筛选或选育梨早熟品种中的应用；
7、(a4)在制备用于筛选或选育梨早熟品种的产品中的应用；
8、(a5)在梨早熟品种的分子标记辅助育种或种质资源鉴定中的应用；
9、所述的snp位点fm_22516479位于梨基因组的6号染色体上的第22516479个碱基处，所述snp位点fm_22516479的物理位置是基于梨的全基因组序列确定的，该梨全基因组的登录号为ajsu00000000，所述snp位点fm_22516479的多态性为g或t，晚熟的杂交后代果实中snp位点fm_22516479为g，早熟的杂交后代果实中为t。
10、进一步，所述物质为如下的(b1)或(b2)或(b3)：
11、(b1)用于扩增含有所述snp位点fm_22516479的梨基因组dna片段的pcr引物；
12、(b2)含有(b1)所述pcr引物的pcr试剂；
13、(b2)含有(b1)所述pcr引物或(b2)所述pcr试剂的试剂盒。
14、更进一步，所述的pcr引物包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。
15、上游引物：gttactgtgaggataaggggatgagaggact(seq id no.1)；
16、下游引物：caggaaaagagatgtaacgatttgagggaa(seq id no.2)。
17、第二方面，本专利技术请求保护前述的物质或前述的pcr引物在制备用于检测所述snp位点fm_22516479多态性或基因型的产品中的应用。
18、第三方面，本专利技术请求保护一种产品，该产品含有前述的物质或前述的pcr引物。该产品可以为含有pcr引物的pcr试剂或试剂盒。
19、第四方面，本专利技术请求保护一种鉴定或辅助鉴定梨早熟品种的方法，检测待测梨种质材料中所述snp位点fm_22516479的基因型，进行如下判断：snp位点fm_22516479基因型为tt的梨果实比gt或gg成熟期短，为早熟基因型。
20、第五方面，本专利技术请求保护一种梨早熟品种分子标记辅助育种的方法，检测待测梨种质材料中所述snp位点fm_22516479的基因型，选择tt基因型的梨种质材料为梨早熟品种种质材料，可以进行培育获得梨早熟品种。
21、进一步，上述的方法中，所述检测待测梨种质材料中snp位点fm_22516479的基因型的方法为：采用前述的pcr引物或前述的产品对待测梨种质材料提取的基因组dna，进行hrm反应，通过分析高分辨率熔解曲线的线型不同，进行待测梨种质材料的基因组dna中snp位点fm_22516479的基因分型，gt和gg为晚熟基因型；tt为早熟基因型。
22、本专利技术的具体实施方式中，所述hrm反应的反应体系20μl：50ng基因组dna，0.3μm的pcr引物，10μl 2×cwstar hrm master mix；扩增程序采用降落式pcr：95℃预变性10min，95℃变性10s、60℃退火10s，sec target为53℃，每循环下降0.5℃，72℃延伸10s的程序进行40个循环；熔解程序为：95℃1min，40℃1min，60℃1s，再从60℃连续升温至95℃，每升高0.02℃，收集荧光1次，降温至37℃。
23、第六方面，本专利技术请求保护含有前述snp位点fm_22516479的分子标记，该snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述的snp位点fm_22516479位于seq id no.3的第277bp处。
24、本专利技术开发出一种与梨果实早熟相关的snp分子标记fm_22516497，针对该分子标记设计相应的引物对，采用该引物对检测杂交后代中梨基因组chr6的第22516479个碱基处的标记。该标记位于第6连锁群的52.731cm处，k*值为8.29。本专利技术还开发出一种基于高分辨率熔解曲线鉴定梨果实早熟相关的snp标记基因型的方法。
25、本专利技术的具体实施方式中，hrm分析在lightcycler480 ii荧光定量pcr仪上进行。所述的高分辨率熔解曲线反应体系按照cwstar hrm master mix说明书进行，总体系20μl。
26、本专利技术的熔解曲线通过在lightcycler480 ii analysis中的gene scanning程序中进行分析，分别以已知的杂交后代母本‘翠冠’和父本‘花盖’为对照，其中‘翠冠’为早熟品种，‘花盖’为晚熟品种。检测杂交后代中qtl位点fm_22516479上的多态性表达果实成熟期的差异。部分后代得到的扩增产物的熔解曲线的颜色和线型和母本‘翠冠’的颜色和线型一致，则表明这些后代的果实表现出早熟现象；部分后代得到的扩增产物的熔解曲线的颜色和线型和父本‘花盖’的颜色和线型一致，则表明这些后代的果实表现出晚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测SNP位点FM_22516479多态性或基因型的物质在下述任一项中的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为如下的(B1)或(B2)或(B3)：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
4.权利要求2中所述的物质或3中所述的PCR引物在制备用于检测权利要求1中所述SNP位点FM_22516479多态性或基因型的产品中的应用。
5.一种产品，其特征在于，该产品含有权利要求2中所述的物质或权利要求3中所述的PCR引物。
6.一种鉴定或辅助鉴定梨早熟品种的方法，其特征在于，检测待测梨种质材料中权利要求1中所述SNP位点FM_22516479的基因型，进行如下判断：SNP位点FM_22516479基因型为TT的梨果实比GT或GG成熟期短，为早熟基因型。
7.一种梨早熟品种分子标记辅助育种的方法，其特征在于，检测待测梨种质材料中权利要求1中所述SNP位点FM_22516479的基因型，选择
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述检测待测梨种质材料中SNP位点FM_22516479的基因型的方法为：采用权利要求2或3中所述的PCR引物或权利要求5中所述的产品对待测梨种质材料提取的基因组DNA，进行HRM反应，通过分析高分辨率熔解曲线的不同，鉴定后代不同的基因型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述HRM反应的反应体系20μL：50ng基因组DNA，0.3μM的权利要求2或3中所述的PCR引物，10μL 2×CWStar HRM Master Mix；扩增程序采用降落式PCR：95℃预变性10min，95℃变性10s、60℃退火10s，Sec Target为53℃，每循环下降0.5℃，72℃延伸10s的程序进行40个循环；熔解程序为：95℃1min，40℃1min，60℃1s，再从60℃连续升温至95℃，每升高0.02℃，收集荧光1次，降温至37℃。
10.含有权利要求1中所述SNP位点FM_22516479的分子标记，其特征在于，该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的SNP位点FM_22516479位于SEQ ID NO.3的第277bp处。
...【技术特征摘要】
1.检测snp位点fm_22516479多态性或基因型的物质在下述任一项中的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质为如下的(b1)或(b2)或(b3)：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的pcr引物包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。
4.权利要求2中所述的物质或3中所述的pcr引物在制备用于检测权利要求1中所述snp位点fm_22516479多态性或基因型的产品中的应用。
5.一种产品，其特征在于，该产品含有权利要求2中所述的物质或权利要求3中所述的pcr引物。
6.一种鉴定或辅助鉴定梨早熟品种的方法，其特征在于，检测待测梨种质材料中权利要求1中所述snp位点fm_22516479的基因型，进行如下判断：snp位点fm_22516479基因型为tt的梨果实比gt或gg成熟期短，为早熟基因型。
7.一种梨早熟品种分子标记辅助育种的方法，其特征在于，检测待测梨种质材料中权利要求1中所述snp位点fm_22516479的基因型，选择tt基因型的梨种质材料为梨早熟品种种质材料，可以进行培育获得梨早熟品...
【专利技术属性】
技术研发人员：张绍铃，谷超，郭志华，齐开杰，谢智华，张正茂，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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